PUF蛋白的研究進展

張 靜，王文珍，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321000）

細胞能夠精準地控制mRNA在恰當的時候在特定的位置產生定量的蛋白質，而RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs） 和小 RNA（miRNA）控制著這些進程。它們結合特定的mRNAs，從而控制mRNA的穩定性、翻譯過程和定位[1]。一個RNA結合蛋白能夠結合許多的RNA，從而建造一個龐大的RNA網絡來調控特定的生物學功能。蛋白質結合RNA有多種多樣的方法，并且通常都難以預料是以怎樣的方式結合。目前，存在一些與RNA作用并對其產生影響的工具的使用，類似于短干擾RNA和小分子RNA的使用，但這些工具的使用會降低目標RNA的多樣性和在細胞中的表達量[2]。因此，能夠被設計的工程性RNA結合蛋白是十分具有吸引力的，因為它們能與任何想要的效應結構域相結合，能夠選擇性結合一種特定的RNA目標，從而來研究或者控制某一方面的新陳代謝作用。最早在果蠅D.melanogaster中和線蟲C.elegans中分別發現的PUMILIO和FBF，并以此來命名的PUF蛋白就是這樣一類蛋白質[3-4]。PUF蛋白普遍存在于真核生物中，從酵母、果蠅到小鼠、人類都存在同源基因，并且在細胞分裂、分化及生殖發育方面有著非常重要的作用。PUF家族蛋白通過結合于目的mRNA的3′UTR的特定序列，并聚集其他促進mRNA降解或影響其翻譯表達的蛋白質來調節其表達。PUF蛋白家族大致能夠分為4個分支，其中2個分支是細胞質蛋白[5]。啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的PUF3p，PUF4p和PUF5p是細胞質中PUF蛋白的代表，人類中的PUM1也屬于胞質類[4]。

果蠅PUMILIO是最原始的一種PUF蛋白，其識別的RNA序列特異性較為簡單，并且可被預測。而FBF顯示出與PUMILIO不同的RNA識別特性。Hunchback（hb）mRNA是其中最早發現的一個可被PUF蛋白識別的目標，在果蠅中被PUMILIO識別，其包含一連串的納米響應原件（Nanos Response Element，NRE），NRE 序列在 hb mRNA 的表達過程和胚胎極性建立的過程中是必不可少的[6]。hb NRE的核心序列（5′-U1G2U3A4-U/C5-A6U7A8-3′）是 PUF 蛋白識別目標位點的模型。所有的PUF蛋白都包含一個特異性序列，即RNA結合域，也被稱為Pumilio同源域（Pumiliohomology domain，PUM-HD）或PUF結構域。研究發現[7-8]，PUM-HD包含8個串聯的α-螺旋PUF重復單元，整體呈月牙型。PUF蛋白的RNA識別序列起始于5′-UGUR（R代表嘌呤），緊接著是一些可變的3′序列，其中可能包含著一些保守元素[4]。人類PUMILIO1（PUM1）結合于hb RNA的PUM-HD的晶體結構顯示了PUF重復單元識別RNA序列的大致原理[9]。RNA結合于PUM1的內凹面，每個PUF重復通過3個保守側鏈識別一個RNA堿基，其中，2個側鏈與RNA的堿基邊緣形成氫鍵或者分子間作用力，第3個側鏈堆疊在同一堿基或前一個堿基。RNA與蛋白質之間“反向平行”，核酸鏈的1～8位與蛋白質的8～1位分別相互識別（圖1-a）[10]。這種簡單的一個PUF重復識別一個堿基的識別模式就是典型PUF蛋白識別RNA的基本原理。

1 PUF蛋白的研究現狀

1.1 結構研究

人類PUM1與RNA復合體的晶體結構說明特定的PUF重復識別特定的堿基。這種簡潔的識別模式暗示著PUF蛋白結合序列的堿基特異性可被定點誘變。這種思路已被用于連接效應器結構域或熒光分子與MS2外殼蛋白，但這需要在目的RNA中插入MS2發卡序列[11]。OPPERMAN[12]研究發現，蠕蟲中的2種PUF蛋白可以識別不同長度的核心序列。其中PUF-8識別8個堿基的序列，與hb NRE序列相似，而另一種PUF蛋白FBF更傾向于識別9個堿基的序列，與hb NRE序列相似，但在其第4，5個堿基之間還含有一個額外的堿基。一些研究已經證明，自然環境可以改變PUF蛋白所識別的RNA的特異性。STUMPF等[13]的試驗結果顯示，在線蟲中RNA特異性極其相似的PUF5和PUF6蛋白都含有10個堿基的核心序列，以5′UGU開始3′UGU結束，而這2個蛋白都只含有8個重復序列，說明這些蛋白不是采用一個重復結合一個RNA堿基的模式，其堿基特異性已經被環境所改變。同樣，在啤酒酵母中也存在類似的證據。酵母共表達6種PUF蛋白，這些蛋白調節不同的目的RNA[14-15]，基因組學已經發現，其中的PUF4和PUF5分別識別9個和10個堿基的RNA序列。結構生物化學研究進一步闡釋了PUF蛋白的特異性如何適應更長的序列。MILLER等[16]用酵母PUF4與其識別RNA序列的晶體結構，揭示了9個堿基的RNA序列如何被8個PUF重復所識別。有了PUF4的晶體結構，就知道了它是如何結合9個堿基的目的序列的，而修飾對特異性的改變是否有影響，相同的原理是否適用于其他PUF蛋白呢？對此，OPPERMAN[12]通過構建嵌合蛋白，證明了PUF蛋白的特異性可以通過改變嵌入堿基附近的蛋白質組分而得到轉變。GUPTA[17]用另一種方式研究PUF蛋白對RNA識別序列的適應性，通過研究PUM1結合非同源RNA序列，結果顯示，PUM1與2條非同源的RNA序列有相對較高的親和力，證明了PUF蛋白具有通過游離堿基而優化識別目標的能力，也暗示著PUF蛋白可以進化，從而識別更長的RNA序列。

目前，PUF蛋白與RNA識別特點越來越清晰，我們也更清楚地知道，RNA結合模型是如何識別比從PUM1結構中預期的更大范圍的序列。單個重復的適應性和通過把額外的核苷酸游離于RNA結合面以外的適應能力揭示了為什么PUF蛋白間的RNA結合序列是高度保守。

1.2 功能研究

隨著PUF蛋白與RNA識別模式的深入研究，更多人把研究重點放在了PUF蛋白的作用上。不同的生物體間編碼PUF基因的數量差異非常大，它們在細胞水平上的功能也不盡相同，目前研究的功能已經包括了細胞分化和發育[18-19]、生殖細胞[20]、神經功能與記憶[21-23]、細胞周期[21]以及線粒體生物合成[23]。一直以來，關于PUF的研究都認為，PUF蛋白的典型作用是作為轉錄后抑制子[4]，除了這個作用，在不同的生物體中，PUF蛋白表現出不同的作用。有試驗表明，PUF蛋白還有助于mRNA的激活表達[24-27]和亞細胞定位[28-30]。

WICKENS等[4]首次闡述了PUF蛋白抑制mRNA表達的機制，研究顯示，酵母Puf5特異性地直接結合于Ccr4-Pop2-NOTmRNA腺嘌呤酶復合物的Pop2亞基，從而引導腺嘌呤酶到mRNA，這種細胞質核酸外切酶縮短mRNA poly（A）尾巴[31]，對mRNA的穩定性和翻譯都產生影響。PUF蛋白的激活子功能是一個新的概念，但在不同的生物體中有越來越多的證據表明PUF蛋白具有該功能[24-27]。目前，基于PUF蛋白的激活機制還沒有很明確的定義。有證據顯示[24-27]，PUF蛋白對于mRMA的激活作用可能是直接的，PUF蛋白依賴性的調節作用取決于mRNA 3′UTR上的PUF結合位點。果蠅中的FBF被提到可激活另一個mRNA gel4，但其機制還不清楚，很有可能是通過PUF蛋白和microRNA共同合作實現的[26]。非洲爪蟾蜍也是PUF激活轉錄的一個例子，在其卵母細胞中，Pum結合元件（Pum-binding element，PBE）能促進轉錄激活，由細胞質聚腺嘌呤基化（cytoplasmic polyadenylation element-binding，CPEB）和其同源的細胞質聚腺苷酸化元件（cytoplasmic polyadenylation element，CPE）介導[24]。但其轉錄激活的要求非常嚴格，如果CPE是非典型的，或CPEB出現二聚體，其激活都會失敗，這說明Pum的激活作用可能是因為協同作用，從而使CPEB與轉錄子結合更穩定[24]。動質體目原生動物的寄生蟲布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）中也存在基于PUF蛋白的mRNA激活[27]。Puf9能夠在其細胞周期的S期穩定mRNA，Puf9的消耗會減少與其相互作用mRNA的多樣性，說明Puf9能夠穩定其目標，但若突變Puf9的結合區會導致mRNA的穩定性增加[27]。對此最簡單的解釋是Puf9與轉錄抑制子相互競爭目標mRMA 3′UTR序列[27]。對于是否所有的PUF蛋白都是激活子和抑制子，或者僅限定于某些PUF蛋白，這仍然是一個值得研究的問題。

PUF蛋白還具有mRNA定位的功能，對表達的空間控制具有一定的作用。目前，大多數關于PUF蛋白的定位功能都來自于酵母。其Puf3將mRNA定位到線粒體[22，32]，Puf6對ASH1轉移到酵母出芽過程中能夠促進其不對稱定位[15]，Puf5與過氧化物酶體影響PEX14 mRNA的定位[29]。此外，在果蠅的嗅覺神經元中FBF能夠激活周圍胞體和感覺纖毛egl-4 mRNA的翻譯[26]，在哺乳動物中Pum2可能參與定位神經元中mRNA翻譯[30，33]。有科學家研究了酵母中Puf6和Puf3的作用機制，研究發現，Puf6調節ASH1 mRNA的翻譯和定位[15]，ASH1編碼一個只在子細胞中表達的轉錄抑制子，并不在酵母母細胞中表達。這是由于非對稱和編碼的mRNA的表達[15]。Puf6結合于ASH1的3′-UTR，通過與翻譯起始因子elF5B/Fun12相互作用，從而抑制其在轉移到胚芽過程中的翻譯[28]。當ASH1 mRNA到達了胚芽的目標位置，Puf6被CK2激酶磷酸化，這影響了Puf6與mRNA的結合，從而開啟了ASH1抑制。Puf3與編碼線粒體蛋白的mRNA相互作用[14]，并促進其在線粒體中的定位[22]。有試驗證明了Puf3在線粒體中的作用，Puf3與線粒體定位mRNA發生免疫共沉淀[14]、puf3誘變體中會出現mRNA的錯誤定位[23]、Puf3與線粒體的結合是通過其與ERMES（ER-Mitochondria Encounter Structure）的亞基Mdm12相互作用[32]。除了有助于mRNA的定位，Puf3還會抑制其mRNA并使其脫腺苷化[32，34-35]，目前，還不清楚 Puf3在mRNA定位和抑制間有什么聯系。

1.3 在植物中的研究進展

目前，大多數基于PUF蛋白的研究都集中在酵母、果蠅等模式生物中，也有科學家研究了擬南芥和水稻中的PUF基因家族，發現這2種模式植物的PUF基因家族成員比其他模式物種多得多，可能是由于整個基因組的復制導致了大量的PUF基因[4]。這些大量的PUF蛋白家族成員暗示著它們在細胞中對相關RNA的穩定和翻譯是非常重要的。植物PUF蛋白早期只在關于植物發展史形成的文獻中稍有提及[4，36-38]，也有個別文獻[39]提到擬南芥中PUF蛋白潛在目標mRNA的鑒定。近年來，有文獻[40-41]針對植物中PUF蛋白的作用進行了研究。而植物中由于PUF基因家族數目的龐大，其功能涉及廣泛，目前還未研究透徹。

2 結論

最近證據顯示，PUF是多功能的mRNA調節子，可以作為抑制子、激活子以及mRNA定位因子。基于這些調節子對細胞分化、發育以及干細胞維持等過程的影響，可以認為，PUF蛋白家族采用多種機制來調節目標RNA，從而行使不同的細胞功能。PUF家族對于RNA定位的廣泛作用和其識別作用與mRNA的抑制和激活是如何相互協調的都還不是很清楚。所以，目前需要解決的是PUF蛋白是如何調節眾多特定的目標mRNA，是激活還是抑制，或者二者都有？PUF依賴的調節對于細胞內外的信號又是怎樣變化的？更多的是，我們應該形成一種mRNA靶向功能的共同認識，這就能更清晰地知道PUF目標mRNA的亞細胞定位以及這種定位是如何依賴于PUF的，并且有助于啟發我們去探索基因的時空表達與PUF作用的相互聯系。

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