熒光成像系統對比度分析與成像仿真

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(1.沈陽藥科大學 醫療器械學院, 遼寧 本溪 117004;2.沈陽儀表科學研究院有限公司, 遼寧 沈陽 110043)

引 言

熒光成像技術在醫學及生物領域得到了越來越廣泛的應用,熒光顯微鏡是最早出現的一種熒光成像系統,后續其他種類的熒光成像系統也逐漸產生并被采用[1]。熒光成像系統涉及許多設計環節,比如當觀測樣品更換不同熒光染料時,或廠商升級開發新設備時,往往需要參數論證和產品實驗來實現好的成像效果[2-3]。以系統核心光學元件濾光片為例,開發新產品需經過指標評估、產品設計評審、膜系設計、樣品的試制、測試實驗等環節,開發周期較長[4]。此外,由于濾光片用途的差異,盡管波長范圍較為接近,但對于成像應用領域來說指標冗余,造成不必要的原料消耗和成本升高。最后,單獨從熒光染料和濾光片組的曲線匹配上判斷,很難直觀反映系統的觀察結果,系統廠商也很難提出非常準確的參數要求來匹配新設備。這些原因導致需要反復進行樣品試制和驗證,增加了研制周期。

綜上考慮,為了快速驗證各模塊光譜參數是否匹配且能直觀反映系統成像效果,本文提出了熒光成像鏈路模型。通過該模型對系統成像對比度進行了分析并得到了仿真成像效果,希望該仿真方法能對各類熒光系統的設計和效果評價提供一定幫助和借鑒。

1 原 理

熒光成像系統包括光源、熒光染料、濾光片組、成像光路、CCD圖像采集等模塊。以熒光顯微鏡為例,與普通成像系統不同,濾光片在熒光系統中分離和選擇物質的激發光與發射熒光的特征波段光譜,決定了圖像的背景與信號亮度及對比度[3]。因此,影響成像對比度和背景噪聲的核心器件是濾光片組。熒光物質受到激發發射熒光的時間短暫,熒光的輻射強度相對于激發光源的反射光強度要微弱很多,通常僅為萬分之一的數量級[4-6]。本文忽略成像CCD的光譜響應及噪聲對成像系統的影響,集中分析濾光片組及各模塊間匹配性對成像效果的影響。

熒光染料的熒光發射輻射強度不僅與物質分子有關,還與激發光的強度、染料濃度等因素有關。根據理論分析[7],熒光物質在一定濃度范圍內,熒光強度可以表示為:

If=kI0

(1)

式中:I0為激發光的輻射強度;k為與染料消光系數、量子產率、濃度有關的系數。

成像系統的背景噪聲主要來自光源在光路的漫反射光、系統外部的環境光以及CCD成像器件的暗電流噪聲。熒光成像系統通常在暗室環境下操作,因此背景噪聲大小即背景光強度主要由光源的漫反射光決定。背景光的輻射強度表示為:

Ib=RI0

(2)

式中:R為光路中的漫反射率;I0為光源的輻射強度。通過前面分析可知,k/R應具有10-4的數量級。

熒光成像系統的成像鏈路如圖1所示。

圖1 熒光成像系統成像鏈路Fig.1 Imaging chain of fluorescence imaging system

根據鏈路模型分析,光源通過熒光激發片,形成一定波段分布的激發光。每個波長的激發光都會激發出有特定光譜范圍的熒光。激發光的波長不同,熒光激發效率也發生變化。發射的熒光經過發射片,通過成像光路最終進入CCD成像器件。在可見光范圍內,CCD的光譜響應曲線變化較為平緩,為了簡化模型,將CCD光譜響應率在可見熒光發射帶寬內都近似為100%。

綜上,熒光信號的歸一化強度可表示為:

(3)

式中:S(λi)為光源光譜歸一化輻射強度;Ex(λi)為濾光片組中的激發片光譜透過曲線函數;Q(λi)為熒光染料歸一化激發效率也稱激發光譜;E(λn)為熒光染料歸一化發射效率也稱發射光譜;EM(λn)為熒光濾光片發射片光譜透過曲線函數。

激發光源部分反射光會透過發射片進入CCD成像器件,形成背景光信號,即產生背景噪聲。最終的背景光信號強度可以表示為:

(4)

其中與反射光輻射強度有關的系數R取104,以保證各項歸一化參數計算的輻射強度數量級與式(1)、(2)相吻合。

如果已知光源、濾光片組的光譜曲線以及染料的激發和發射譜線,便可通過式(3)、(4)分別計算出系統后端接收的熒光染料發射的熒光信號強度和背景光強度。將計算得到的強度值進行均勻量化,賦予圖像灰度值,最終可得到模擬的熒光圖像效果。

熒光成像背景較為均勻,采用Michelson對比度定義[8],分析熒光圖像的成像對比度特點,對比度數值可表示為

(5)

式中:c為成像對比度;ΔI=(Imax-Imin)/2;I=Imin。可以看出c是0到1之間的數,可以轉換為百分比表示,其值越大,表明信號明暗差異越大,對比越明顯。從式(5)可以看出,若圖像亮度降低,對比度也相應成比例下降。通過對比度特性可評價系統背景抑制程度,判別濾光片組、光源、染料之間的匹配程度,來指導后續系統設計。

2 仿真分析與結果討論

首先采用鏈路模型分析激發光源為激光的情況。由于激光光源單色性較好,成像系統可以不采用激發濾光片,后續成像效果主要由發射濾光片決定,模型計算較為簡單。模型中各模塊參數如下:激光器中心波長為435 nm,半波帶寬為2 nm;濾光片組型號為Chroma? 39001,發射濾光片透過光譜帶寬外平均的光密度值為6;熒光試劑為Cerulean。模擬的觀測目標由不同的試劑濃度組成,由上到下的目標分別為最大濃度、最大濃度的50%、25%和10%。各模塊之間的光譜參數匹配,根據各模塊的光譜曲線,采用式(3)、(4)計算信號及背景輻照強度。

根據前面的理論分析,染料濃度最大的目標部位亮度最高,建立的其余目標濃度分別遞減,亮度也隨之成比例降低。CCD的光圈和曝光時間設置通常以目標高亮處作為參考,避免出現CCD像元過曝或曝光不足的情況。發射濾光片的真實OD值為6,其仿真結果如圖2(a)所示。假設發射濾光片在設計時,激發光波長附近的OD值只有4,模擬該種情況下的成像效果。得到的仿真結果如圖2(b)所示。進一步降低發射片光密度,使OD值降至3,該情況下的仿真圖像如圖2(c)所示。

當發射濾光片的光密度值為6時,進入CCD的背景光強度很弱,背景噪聲得到了較好的抑制,通過式(5)計算,對比度c為99.79%。從圖2(a)可以看到,通過灰度均勻量化后,圖像背景灰度值為0,最大濃度處灰度值最高。此種情況下,CCD的灰度區間得到了充分的利用,濃度最大和濃度最小的目標都可以被觀察到,灰度圖像層次分明。圖2(b)所對應的濾光片光密度值為4,相對于前一種情況,更多的背景光能夠透過發射片進入到CCD中。圖像的背景亮度增大,10%濃度的目標已經被背景光淹沒,此時背景噪聲已開始對成像產生影響,最亮處的目標還清晰可見,計算得到高亮處對比度為80%。當發射片的OD值降為3時,大量的激發光進入成像光路末端,背景亮度明顯增大。圖2(c)可以看到,觀測目標信號光已完全被背景光所掩蓋,系統無法滿足工作狀態。仿真結果證明,OD值反映了背景信號的截止程度,而背景信號的強度是影響成像對比度效果的因素之一。將不同OD值對應的成像對比度做成關系曲線,如圖3所示。

圖2 不同OD值下的仿真結果Fig.2 Simulated results under different OD conditions

圖3 對比度與OD關系曲線Fig.3 Relationship between contrast and OD

通過圖3的曲線關系可以發現,濾光片光密度值在3～5之間時,對比度變化趨勢明顯;當OD值大于5后,對比度變化趨于平緩。從曲線關系可以看出,繼續增加濾光片OD值對于提高成像對比度已無明顯作用,反而會增加不必要的設計難度和制造周期。

背景信號截止深度的OD值大于5后,對比度隨著OD值增加逐漸平緩,所以成像用濾光片的設計OD值通常在5～7之間。而OD值大于7的濾光片對于微弱信號采集具有重要作用,因此往往用在對探測靈敏度要求更高的其他熒光檢測領域[9]。以上分析與實際產品設計和應用是相吻合的,側面反映出該模型對于背景噪聲的仿真具有可行性。

當前熒光成像系統的光源廣泛使用LED作為激發光源[10-11],為了能夠真實模擬熒光顯微鏡光源、染料、濾光片組的光譜參數匹配效果,并且能將仿真圖像與真實系統進行對照,下面將LED激發光源光譜曲線導入模型作進一步仿真驗證。光源采用的是525 nm綠光LED,半寬40 nm,熒光染料及配套濾光片組的光譜曲線如圖4所示。

圖4 熒光試劑受激發射與濾光片的光譜Fig.4 The spectrum of fluorescence reagent excitation and fluorescence filter

通過各模塊歸一化光譜曲線,利用式(3)、(4),可模擬出參數匹配下系統的熒光成像效果,結果如圖5(a)所示。對于配套的濾光片組,光源、濾光片、熒光染料的光譜曲線匹配較好,能夠保證較高的激發光效率和熒光發射強度,圖像具有良好的亮度和對比度。濾光片組在膜系設計時,均會考慮激發片與發射片兩者的背景交叉點的OD值在6左右,即保證背景的截止深度[2],而往往難以把握的是濾光片組與染料試劑的相互匹配。為了驗證濾光片與染料試劑未良好匹配的影響,將濾光片的發射片中心波長由617 nm替換為677 nm,帶寬仍為55 nm,模擬該情況下的成像效果,仿真結果如圖5(b)所示。與替換前相比,兩組的激發片和發射片的背景交叉點均滿足OD值在6以上,但是發射片與染料發射光譜未完全匹配。

通過圖6仿真結果看到,兩種情況的背景噪聲都得到了較好的抑制,但圖像整體亮度發生了變化。這是由于發射片向長波方向移動后,透過光譜偏離了染料的熒光發射峰,進入到CCD的目標信號強度降低。CCD將接收的熒光信號均勻量化后,圖像并未充分利用量化的灰度范圍,這是因為圖像亮度降低,灰度區間被壓縮。這導致圖像的灰度層次不再豐富,圖像不利于觀察,圖像對比度會成相應比例下降[12],并且低亮度目標即低濃度區域的細節也會丟失。由此可以發現,熒光圖像的對比度不僅和背景強度的抑制程度有關,還與各模塊的參數是否匹配息息相關。

為驗證仿真圖像的可信度,使用熒光顯微鏡對上述濾光片組進行了實際測試。測試前準備了兩套濾光片組,一組光譜曲線參數匹配較好,另一組發射片中心波長向長波偏移60 nm。圖6展示了依次替換兩組濾光片,分別采集到的組織樣本圖像。圖6(a)為采用與光源和染料匹配的濾光片組,完整呈現了組織輪廓;圖6(b)則采用了另一組匹配性不好的濾光片組,組織邊緣低染色濃度的區域細節丟失。對比可知,測試中發射片與熒光試劑的發射光譜不完全匹配,會造成CCD采集熒光圖像信號衰弱和對比度下降,組織邊緣的細節消失。實際系統成像的效果與仿真結果相吻合,證明了該鏈路模型仿真方法的正確性和有效性。

圖5 熒光成像系統仿真圖像Fig.5 Simulated images of fluorescence imaging systems

圖6 熒光顯微鏡采集真實圖像Fig.6 Images obtained by the fluorescence microscopy

3 結 論

熒光成像系統的設計涉及多個模塊,為了縮短產品設計周期并驗證各模塊參數匹配度,且能更直觀地反映系統的成像效果,本文提出了熒光成像鏈路模型。利用該鏈路模型,對熒光成像過程進行了分析與仿真,驗證了濾光片OD值這一影響對比度主要因素,結論與熒光濾光片設計思路相吻合。另外,熒光成像系統各模塊是否良好匹配,也會對圖像的對比度和亮度產生影響。本文最后從熒光顯微系統入手,通過模型直觀仿真了模塊不匹配對圖像效果的影響,仿真結果與實際成像效果一致,證明該鏈路模型仿真的可行性和有效性。

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