遺傳性對稱性色素異常癥一家系ADAR1基因突變檢測

高 杰 崔紅宙 王 霆 郭書萍

遺傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symmetrica hereditaria，DSH，OMIM127400)是一種以對稱分布于手背、足背的雀斑樣色素沉著及色素減退斑為臨床表現的常染色體顯性遺傳病[1]。2003年，Zhang等[2]在2例中國漢族家系內將本病定位在1q11～1q12區間內，同年Miyamura等[3]采用全基因組掃描及候選基因測序的方法，在上述定位區域內發現致病基因ADAR1。本研究前期確診并收集1例中國漢族DSH家系(圖1)，現對ADAR1基因外顯子區域進行測序，發現位于第13號外顯子上的錯義突變c.3232C>T在家系內傳遞。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 先證者(III2)，女，20歲。自2歲開始雙手、足背出現散在點狀白色及褐色斑疹，隨著年齡增長皮疹稍增多，無自覺不適。智力及發育正常，其他系統檢查未見異常。皮膚科查體見雙手背及足背對稱分布點狀針尖至綠豆大的褐色斑點，其間可見色素減退斑，部分皮疹融合成斑片(圖2)。面部、口腔黏膜、軀干及掌跖部位無類似皮損。先證者母親和外祖父手足背部也出現對稱分布的色素減退斑和色素沉著，出生即有，病情程度有差異，但較先證者輕。該家系符合常染色體顯性遺傳。結合家族史及臨床表現，診斷為：遺傳性對稱性色素異常癥。健康對照100名均來自于我院體檢中心的患者，簽署知情同意書，研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取 抽取先證者(III2)、先證者母親(II1)及該家系表型正常者(II3、II6)的外周靜脈血5 mL，置于2% EDTA抗凝管中，-80℃低溫儲存。應用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德國)提取基因組DNA，同時提取100名與該家系無親緣關系的健康個體作為對照，以排除基因的多態性。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 采用Primer 5.0軟件針對ADAR1基因外顯子區和側翼序列設計引物，交由上海生工生物技術服務有限公司合成。其中第13號外顯子引物為：上游5’-CTGTGGTAGGAAGATCCTGGTA-3’，下游5’-CAACGGGAGAAAGATGGAAA-3’。PCR反應條件：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃終極延伸5 min。

1.2.3 DNA測序 PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，交由上海生工生物技術服務有限公司進行Sanger測序，測序結果使用Chromas軟件解讀，并與人類基因組數據庫中ADAR1基因序列進行比對。

2 結果

該家系患者ADAR1基因第13號外顯子發現錯義突變c.3232C>T(圖3)，突變使得第1078位表達氨基酸由精氨酸(Arg)變成半胱氨酸(Cys)(p.R1078C)，表型正常的家族成員及100名無親緣關系的正常人對照中均未發現該突變位點。

圖1 DSH家系圖(I：1、II：2為患者，III：2為先證者)圖2 先證者臨床表現(a，b)：雙手背及足背對稱分布點狀針尖至綠豆大的褐色斑點，其間可見色素減退斑，部分皮疹融合成斑片

圖3 ADAR1基因第13號外顯子錯義突變c.3232C>T(A：患者，B：健康對照者)

3 討論

遺傳性對稱性色素異常癥首次在日本人群中發現，其主要見于黃種人，男性多于女性，其臨床表現為四肢伸側，尤其是手、足背對稱性彌漫分布色素減退及色素沉著斑，面部的皮損表現類似于雀斑。無明顯自覺癥狀，夏重冬輕。目前尚無特殊療法。

3.1 發病機制 DSH表現為常染色體顯性遺傳，自2003年Miyamura等[3]在4個DSH家系中發現了ADAR1的雜合突變，目前已經發現有140種以上ADAR1基因突變位點[4-10]，以錯義突變及移碼突變最為多見[11-13]。其中錯義及無義突變80種，剪接突變11種，缺失突變37種，插入突變13種。ADAR1基因包含15個外顯子，編碼含有1226個氨基酸序列的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶(RNA-specific adenosine deaminase 1)，該酶含有6個功能域，分別包含2個Z-DNA結合結構域(Z-DNA-binding domin in adenosine deaminases，Zalpha)；3個ds-RNA結合區域(doublestranded RNA binding motif，dsrm)；1個腺苷脫氨催化區(tRNA-specifific and double-stranded RNA adenosine deaminase，ADEAMc)，其中ADEAMc區由第886位至1221位氨基酸所編碼，在人、牛等哺乳動物中高度保守[14]，在RNA的編輯中發揮著重要的作用，編碼結構實現腺苷的脫氨基作用[15]，是基因的功能核心區域。目前報道的基因突變幾乎均局限于ADEAMc區域[4，5]。RNA編輯功能障礙可以影響一系列生物活性。Miyamura等[3]認為，RNA編輯的失敗能夠影響黑素母細胞的分化，產生高活性及低活性兩種不同的黑素細胞。另外，李聰穎等[16]證實HaCaT細胞中ADAR1基因沉默可降低Wnt蛋白的表達，Wnt信號通路參與毛囊干細胞和黑素干細胞的協調作用[17]，黑素干細胞中Wnt信號通路失活可以影響A375細胞酪氨酸酶活性，最終導致色素異常。

3.2 突變與表型可能的關系 本研究通過對1例中國漢族DSH患者進行ADAR1基因編碼區測序發現在第13號外顯子上錯義突變c.3232C>T，導致位于ADEAMc功能域的第1078位氨基酸由精氨酸(Arg)變成半胱氨酸(Cys)，此突變曾于2004年在漢族種群中首次報道。使用PolyPhen-2軟件進行蛋白功能的預測，預測結果為 probably damaging (score=1.0)。本研究發生于ADAR1基因突變可能導致有害的蛋白表達，影響ADEAMc結構穩定性，導致RNA編輯的失敗，影響黑素母細胞的分化，以致產生高活性及低活性兩種不同的黑素細胞，推測可能參與DSH色素的異常。另外，本研究中的ADAR1基因錯義突變的發生也有可能降低Wnt蛋白的表達，或者影響A375細胞酪氨酸酶的活性，推測可能參與DSH表型的發生。

3.3 展望 目前熱點突變找尋使得DSH疾病診斷以及表型分型不斷完善。但仍有基因型-表型不匹配，如不伴ADAR1基因突變的DSH發病以及明確伴ADAR1基因突變的DSH患者中合并頭發顏色改變、牙齒異常和自身免疫性疾病等[18]，下一步我們以ADAR1基因導致皮膚色素異常表型的機制展開工作，同時重點關注不伴ADAR1基因突變的DSH的致病基因找尋。

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