芥藍1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因BaDXS1的克隆及原核表達

薛生玲，江 敏，常嘉琪，劉 洋，魏 淋，周建坤，張 芬，孫 勃，*

(1.四川農業大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.浙江大學 園藝系，浙江 杭州 310058)

芥藍(Brassicaalboglabra)屬十字花科蕓薹屬蔬菜，主要以花薹和嫩葉為食用器官，起源于我國南方，在廣東、福建等地區廣泛栽培[1]。芥藍具有悠久的栽培歷史和豐富的種質資源，因其富含維生素C、芥子油苷、類胡蘿卜素及總酚等物質，而具有極高的營養價值和保健作用[2]，深受廣大人民群眾的喜愛。

類胡蘿卜素是萜類物質[3]，在植物質體中主要依靠2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)合成[4]。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)是該途徑的首要限速酶，Lois等[5]研究發現，在番茄的成熟過程中，DXS的表達量與類胡蘿卜素的積累成正比；Estévez等[6]通過在擬南芥中超量表達DXS基因，葉綠素、類胡蘿卜素、維生素E、赤霉素和脫落酸等萜類物質的含量都提高了，而將DXS基因沉默后，這些物質含量均降低了；潘夕春等[7]通過將番茄DXS基因轉入已重建了番茄紅素生物合成途徑的大腸埃希菌中，發現該菌能大量積累番茄紅素。這些研究結果顯示，DXS表達量的高低與上述萜類物質的含量成正相關，進一步證實了DXS是萜類物質生物合成途徑中的一個關鍵酶。目前，DXS基因已從番茄[7]、玉米[8]、魚腥草[9]、茉莉花[10]、思茅松[11]、土豆[12]等多種植物中成功分離，而芥藍中尚未發現有關該基因的報道。

本研究采用RT-PCR方法，以芥藍葉片為材料，首次分離出BaDXS1基因的CDS全長，對該基因序列進行生物信息學分析，并構建原核表達載體，將該基因轉化至大腸埃希菌體內，進行誘導表達。本實驗為進一步研究BaDXS1基因的生物學功能及芥藍中類胡蘿卜素的合成調控提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為白花芥藍品種明豐香菇，待幼苗長出3～4片真葉，剪取其新鮮葉片進行總RNA提取，用于后續實驗。

1.2 實驗試劑

反轉錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、EmeraldAmp Max PCR Master Mix(2×Premix)、Premixed Protein Marker(Broad)(6.5～200 ku)等購于大連寶生物公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal、氨芐青霉素(Amp)等購于上海生物工程有限公司，TransStartFastPfuFly DNA Polymerase聚合酶、pEASY-Blunt Cloning Kit、pEASY-Blunt E1 Expression Kit、BL21(DE3)表達感受態細胞、Trans1-T1克隆感受態細胞等購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 總RNA提取與反轉錄cDNA合成

用改良的CTAB法[13]提取芥藍明豐香菇的總RNA，參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行cDNA模板的合成，所得產物于-20 ℃保存。

1.4 基因克隆

根據NCBI已公開的甘藍、白菜等同源物種的DXS基因序列設計芥藍特異性引物(表1)，引物送至上海生工生物工程公司合成。PCR擴增反應體系(40 μL)：模板1.6 μL，引物(10 μmol·L-1)各1.6 μL，緩沖液8 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 3.2 μL，Taq酶0.8 μL，ddH2O 23.2 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 33 s，共40個循環；72 ℃再延伸10 min；12 ℃保存。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收產物。將產物連接至平末端pEASY-Blunt克隆載體上，轉入大腸埃希菌Trans1-T1克隆感受態細胞中，挑取陽性單菌落擴大培養，經菌液PCR篩選后，送至上海生工生物工程公司測序。

1.5 生物信息學分析

利用NCBI-ORF、ExPASy在線軟件計算其分子量、等電點、不穩定系數等理化性質；TMHMM軟件分析和推測蛋白質跨膜結構；WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位預測；ChloroP 1.1軟件預測是否存在轉運肽；在NCBI網站上用BLAST程序及DNAMAN軟件進行同源序列比對及保守結構域分析； DNAMAN軟件進行系統進化樹的構建[14-15]。

1.6 原核表達載體構建及表達

利用Rare Codon Calculator(RaCC)在線軟件對芥藍BaDXS1序列進行稀有密碼子分析。將純化回收后的芥藍BaDXS1基因片段與原核表達載體pEASY-Blunt E1在25 ℃下連接30 min，連接產物轉化至大腸埃希菌Trans1-T1克隆感受態細胞，涂在LB(含Amp)固體培養基上，挑取白色單菌落，經菌液PCR和測序等檢測，采用堿裂解法提取篩選出的重組質粒pEASY-Blunt E1-BaDXS1。將提取的重組質粒轉入大腸埃希菌表達感受態BL21(DE3)細胞，在D值為0.6～0.8、37 ℃條件下經1 mmol·L-1的IPTG誘導表達8 h后提取蛋白。最后，將處理的樣品取10 μL經SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，檢測目的蛋白在大腸埃希菌內的表達情況和存在形式。

表1 芥藍BaDXS1基因克隆引物Table 1 The cloning primer of BaDXS1 in Brassica alboglabra

2 結果與分析

2.1 芥藍DXS1基因的克隆

將PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后(圖1)，得到一條約2 000 bp的條帶，與目的基因DXS的片段大小相符。測序后，確定該序列的CDS全長為2 139 bp，并將其定名為芥藍BaDXS1。

2.2 生物信息學分析

利用NCBI-ORF和ExPASy軟件對芥藍BaDXS1基因所編碼的氨基酸進行理化分析，結果表明，BaDXS1由712個氨基酸殘基組成，氨基酸種類和比例見圖2；分子式為C3417H5418N962O1019S29；理論分子量為77.21 ku，等電點(pI)為8.59，為堿性蛋白；不穩定指數為36.69，屬穩定蛋白；脂肪指數為85.07，平均親水系數為-0.160。利用TMHMM軟件預測BaDXS1蛋白無跨膜結構。亞細胞定位軟件WoLF PSORT預測BaDXS1蛋白位于葉綠體。在線軟件ChloroP預測BaDXS1蛋白的N端具有41個氨基酸的質體轉運肽序列。

M，DL2000; 1，PCR產物。M，DL2000; 1，PCR products.圖1 BaDXS1基因PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification products of BaDXS1

利用NCBI-CDD對BaDXS1氨基酸序列進行保守結構分析(圖3)，發現該蛋白含TPP結合位點、轉酮醇結構域、1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合酶嘧啶結合功能域等多個結構域。對BaDXS1氨基酸序列與6種不同植物的DXS氨基酸序列進行NCBI-BLAST比對并結合DNAMAN軟件進行分析，芥藍DXS1與甘藍(Brassicaoleracea，XP_013622774.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，AAC49368.1)、番茄(Solanumlycopersicum，NP_001234672.1)、煙草(Nicotianatabacum，NP_001312959.1)、菠菜(Spinaciaoleracea，KNA08069.1)和橙子(Citrussinensis，KDO74968.1)的DXS氨基酸相似性分別為100%、84.56%、79.69%、79.78%、77.27%和78.84%。序列比對結果表明，DXS氨基酸序列的相似性較高，說明該蛋白在進化過程中高度保守，且C端序列相較于N端序列保守(圖4)，ChloroP 1.1預測顯示BaDXS1的N端含一段41個氨基酸的轉運肽序列。

圖2 芥藍BaDXS1蛋白的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of BaDXS1

圖3 BaDXS1蛋白保守結構域分析Fig.3 Conserved domains analysis of BaDXS1

Ba，芥藍; Bo，甘藍; At，擬南芥; Sl，番茄; Nt，煙草; So，菠菜; Cs，橙子。Ba，Brassica alboglabra; Bo，Brassica oleracea (XP_013622774.1); At，Arabidopsis thaliana (AAC49368.1); Sl，Solanum lycopersicum (NP_001234672.1); Nt，Nicotiana tabacum (NP_001312959.1); So，Spinacia oleracea (KNA08069.1); Cs，Citrus sinensis (KDO74968.1).圖4 DXS蛋白的氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of DXS

根據NCBI已公布的不同物種的DXS氨基酸序列，選取16種與芥藍BaDXS1蛋白進行系統進化樹分析，采用鄰近法(neighbor-joining)構建系統發育樹(圖5)。該進化樹分為3個大的分支，第一大分支包括十字花科的芥藍、甘藍、歐洲油菜、白菜、蘿卜、薺菜及擬南芥和茄科的煙草、番茄、土豆及南非醉茄2個小支；第二大分支包括蕓香科的克萊門柚及橙子和大戟科的橡膠樹、麻瘋樹及蓖麻2個小支；楊柳科的毛果楊單獨形成1支。結果表明，同科物種間的DXS在進化過程中親緣關系較近，其中十字花科芥藍BaDXS1與其同屬的甘藍BoDXS親緣關系最近。

2.3 原核表達

將重組質粒pEASY-Blunt E1-BaDXS1轉化至大腸埃希菌表達感受態細胞BL21(DE3)中，經IPTG誘導后，提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色檢測(圖6)，在66.4～97.2 ku間出現特異性條帶，與預測蛋白的相對分子量77.21 ku基本一致，表明芥藍BaDXS1蛋白在大腸埃希菌體內成功表達。進一步分離上清和沉淀中的蛋白，檢測結果顯示，大部分目的蛋白存在于沉淀中，表明該蛋白在大腸埃希菌體內主要以包涵體的形式存在。

3 討論

在植物中，DXS作為MEP途徑的首要限速酶，最早是在胡椒薄荷[16]和擬南芥[17]中分離獲得的。本研究首次分離了芥藍DXS1基因，該基因CDS區全長為2 139 bp，可編碼712個氨基酸。對BaDXS1蛋白進行亞細胞定位預測和分析，顯示該蛋白很可能位于葉綠體。根據BaDXS1蛋白氨基酸序列與其他6個不同物種的DXS氨基酸序列比對發現，該序列N端相較于C端的保守性較差。BaDXS1蛋白的N端序列中富含絲氨酸和蘇氨酸，而含少量的酸性氨基酸，這與葉綠體轉運肽的性質相符，該結果與BaDXS1蛋白的亞細胞定位預測結果相一致。推測該蛋白是在葉綠體轉運肽的引導下，定位于葉綠體，而該蛋白的C端序列因含多種結構域而高度保守，其可能在葉綠體內催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸這個過程中起作用[11]。

圖5 17種不同物種的系統進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of 17 different species

M，Protein marker(6.5～200 ku); 1～4，總蛋白檢測; 5～6，上清中蛋白檢測; 7～8，沉淀中蛋白檢測。1，未誘導空載; 2，誘導空載; 3，未誘導BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1); 4，誘導8 h的BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1); 5、7，未誘導BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1); 6、8，誘導8 h的BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1)。M，Protein marker(6.5～200 ku); 1-4，Detection of total protein; 5-6，Detection of protein in the supernatant; 7-8，detection of protein precipitation; 1，non-induced control; 2，Induced control; 3，Non-induced expression products of pEASY-Blunt E1-BaDXS1 in BL21(DE3); 4，pEASY-Blunt E1-BaDXS1 transformed bacterial cells induced respectively for 8 h in BL21(DE3); 5，7，non-induced expression products of pEASY-Blunt E1-BaDXS1 in BL21(DE3); 6，8，pEASY-Blunt E1-BaDXS1 transformed bacterial cells induced respectively for 8 h in BL21(DE3).圖6 重組質粒pEASY-Blunt E1-BaDXS1在大腸埃希菌中的表達檢測Fig.6 Expression of pEASY-Blunt E1-BaDXS1 in Escherichia coli

本研究中，BaDXS1蛋白在大腸埃希菌中成功表達，但其表達量較低。外源基因結構(如密碼子偏好性)和表達條件均會影響外源基因在大腸埃希菌體內的表達[18]。本實驗中，我們對BaDXS1基因進行稀有密碼子分析，發現該基因具有多個稀有密碼子，其中含1個六聯體和多個二聯體，當外源基因中含有成串或多個大腸埃希菌稀有密碼子時，則會導致翻譯很難進行，目的蛋白表達量過低[19]。我們在實驗過程中采用的是不含稀有密碼子的大腸埃希菌表達感受態BL21(DE3)，這可能是導致該蛋白表達量較低的原因之一；另一方面，依據劉永強等[20]研究發現，誘導溫度及誘導時間對重組蛋白在大腸埃希菌中的表達量產生顯著影響，而誘導前菌液濃度和IPTG濃度對蛋白的表達量影響不顯著。本實驗中采用的誘導溫度為37 ℃、誘導時間為8 h，可能是由于誘導溫度較高、誘導時間較短，進而影響重組蛋白在菌體內的表達量較低。我們將在后續實驗中采用含有稀有密碼子的大腸埃希菌表達感受態細胞、降低誘導溫度及延長誘導時間等手段，進一步優化原核表達體系，使BaDXS1蛋白獲得高效表達。

不同植物中，DXS基因家族成員的數目及功能也各自不同，如番茄只有1個DXS基因[5]，擬南芥中有3個DXS基因，但只有1個DXS蛋白具有催化功能[21]，柑橘中有3個DXS基因，其中CitDXS1起主要作用[22]。目前，芥藍中還未發現有關BaDXS基因家族成員的數目及相應功能的報道。本研究為進一步研究BaDXS1基因功能奠定了基礎，同時也有助于芥藍DXS基因家族其他成員的分離及功能研究。

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