提高生物樣品電鏡圖像反差的幾點體會

劉湘花, 張俊霞, 王會麗, 李曉冰

(河南中醫藥大學 a.病理實驗中心；b.基礎醫學院，鄭州 450046)

0 引 言

電鏡最突出的優越性主要表現在其具有很高的分辨率，適用于各種研究樣品的需要，在生物學研究領域中是其他儀器所無法取代的[1]。在電子顯微技術中，生物樣品需要用重金屬鹽類浸染，使樣品中各種細胞器或大分子吸附不同數量的重金屬原子，以增加樣品內各種結構的電子密度，增加圖像反差 。由于生物體組織和細胞成分主要是由C、H、O、N等輕元素組成，這些原子序數低，對電子的散射能力較弱，相互之間的差別很小，且制作超薄切片時通常把生物樣品包埋在環氧樹脂[2]中，這些聚合樹脂也多為輕元素組成，這樣會造成樣品與包埋劑兩者質量厚度差異很小。由于以上原因，生物樣品本身的固有反差很弱。因此，必須采取適當的措施來提高圖像的反差，本實驗室在制樣處理和電鏡操作技術方面積累了一些增加圖像反差的經驗。

1 傳統染色方法的改良

傳統的染色方法是采用醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛雙染法[3]。本實驗室采用“漂浮式滴染法”[4]，電鏡下觀察組織結構清晰、無污染。但樣品用戊二醛固定時間過長，用此方法染色后，細胞結構反差不夠理想，這時可再重復鈾染(10 min)鉛染(5 min)1次，能明顯提高樣本反差(見圖1、2)。

圖1 傳統方法染色，線粒體結構顯示模糊

圖2 改良方法染色，線粒體結構明顯清晰

在重金屬鹽染色過程中，容易出現染色效果欠佳，分析其原因及克服方法：①標本本身前固定處理不好，標本體積過大，取材時間過長，取材環境溫度過高等。 因此標本體積盡可能地小(1 mm×1 mm×1 mm)，快速取材，降低取材環境溫度；②后固定時鋨酸沒有完全滲透固定，主要是標本體積過大所致，在不影響研究結果的前提下越小越好[5]；③染液pH的影響，一般醋酸鈾pH值為4.5，檸檬酸鉛pH為12，效果較好；④水洗工具的改進。傳統的水洗是用燒杯裝有雙蒸水水洗，本實驗室為避免鉛污染，用封口膜代替傳統的燒杯水洗，水洗時間30 min。本實驗室采用注射器，把注射器的尖頭磨平后用細流水反復沖洗銅網的正反面約2 min，大大縮短了水洗時間，且操作簡單，沒有污染;⑤樣品結構反差強弱，與染液溫度有關，當染液從4 ℃冰箱中取出后，不要立刻進行染色，而應將染液在室溫中放置一段時間，使染液溫度達到室溫，否則即使增加染色時間，也不能獲得良好反差。

2 重金屬投影噴鍍

本實驗室采用掃描電鏡的噴鍍技術[6]，具體方法是在樣本鈾染和鉛染后，在生物樣品表面再噴涂一層碳離子，能明顯提高圖像反差，組織微細結構分辨率明顯提高。解決了高分辨率和增加反差之間的矛盾。

3 碳膜代替方華膜撈片

一般撈片都用方華膜[7]或者裸網撈片。方華膜在電子束的照射下容易產生漂移，甚至使膜破碎，損壞被觀察樣品。本實驗室采用碳膜撈片。與其他制膜材料比較，碳的密度較高，散射能力較強，碳膜的機械強度、親水性及其熱穩定性都優于其他種類的支持膜，進而可減少樣品的熱漂移，增加樣品的穩定性[8-9]。碳膜在高分辨率觀察時使用，其厚度在2～10 nm，其缺點是易碎，制好的碳膜不易長久保存。

4 樣品切片厚度對圖像反差的影響

生物超薄切片厚度為50～100 nm，切片越薄越利于電子束的透過，且散射電子少，成像的亮度大，色差小，分辨率高[10-11]。但過薄的切片，由于其質量厚度太小，成像的反差反而較弱，不利于觀察。所以，通常在保證一定分辨率的前提下，選擇適當的切片厚度(75 nm)，可以增加圖像的反差。

5 選擇小孔徑光闌

物鏡光闌孔徑越小，圖像反差越大[12]。但反差的提高并不與光闌的大小成正比，當光闌過小時，會造成圖像亮度過暗，容易產生污染或散射。所以在物鏡光闌的選擇時，應兼顧其他的成像因素[13-14]。

6 降低加速電壓

電子散射角度的大小與加速電壓的平方成反比，降低電子加速電壓可以提高圖像的反差[15]。但加速電壓降低時，低速電子波易受雜散電磁場干擾，同時電子的穿透力低，色差增大，最終會造成分辨率的降低。

7 正確的欠焦

在電鏡觀察樣品時，樣品質量厚度迅速改變區域所對應的圖像上會出現費涅爾衍射環。當物鏡過焦時，費涅爾條紋成暗線，欠焦時則呈現亮線;在正焦時，費涅爾條紋消失【4】。樣品要求電鏡高倍率觀察時，利用費涅爾衍射環來增加圖像反差，選擇適當的欠焦量，可獲得最好的圖像反差，但欠焦量不宜過大。通常不能用過焦的方式來提高反差。

8 結 語

影響生物電鏡圖像反差的因素很多，圖像的反差除與樣品本身密度和厚度有關，還與電子顯微鏡的工

作條件有關，只有注意到以上每個實驗操作環節，才能得到較滿意的圖像反差效果。

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