染料木素對UVA誘導成纖維細胞急性光損傷的防護作用

宗興燕 楊秀華 陳宏泉 王 璐 陸曉鷗

日光中的長波紫外線(UVA)是皮膚光損傷的主要原因，它具有較強的穿透力，約20%～30%能夠穿過表皮到達真皮引起膠原蛋白減少和異常彈力纖維沉積[1，2]。短時間大劑量照射UVA可致皮膚出現(xiàn)疼痛性紅斑、水皰及發(fā)熱、惡心等急性光損傷表現(xiàn)，同時UVA可誘導活性氧生成，引起氧化應激反應，致使成纖維細胞損害或凋亡[3，4]。研究表明大豆異黃酮能預防紫外線照射所致的皮膚損傷，染料木素是大豆異黃酮中的一種有效成分，具有與雌激素相似作用[5，6]，可抗氧自由基損傷，促進人皮膚成纖維細胞的膠原蛋白合成，減輕輻射的損傷[7]。

本實驗根據(jù)參考文獻及預實驗選用10 J/cm2UVA照射成纖維細胞建立急性光損傷模型[8]，以染料木素為光防護劑，檢測染料木素對UVA所致成纖維細胞光損傷過程中細胞凋亡、Sirt1mRNA表達的影響，以探討染料木素對UVA誘導成纖維細胞急性光損傷的防護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 100 mmol/L染料木素由青島大學陳文芳老師惠贈，用DMSO稀釋成相應濃度。實驗使用的皮膚標本取自包皮切除術(shù)切除的人正常包皮，供皮者年齡為15～25周歲，由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院低溫醫(yī)學科提供。紫外輻照儀，紫外燈管由北京師范大學光電儀器廠制造(波長320～400 nm，峰值365 nm)；CCK8試劑盒、流式試劑盒、RT-PCR試劑盒購自Takara公司；凝膠成像分析儀由法國VILBE R LOURMAT制造。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組將成纖維細胞分為7組。A組：空白對照組,不照射UVA,不加染料木素；B組：UVA照射對照組，加10-3μmol/LDMSO；C組：0.01 μmol/L染料木素組；D組：0.1 μmol/L染料木素組；E組：1 μmol/L染料木素；F組：10 μmol/L染料木素組；G組：100 μmol/L染料木素組；C～G組均照射UVA。

1.2.2 成纖維細胞培養(yǎng) 成纖維細胞用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 照射方法 待成纖維細胞貼壁生長至80%左右融合時，從細胞培養(yǎng)箱中取出，無菌條件下加入不同濃度染料木素。空白對照組只加成纖維細胞專用培養(yǎng)基以使各孔的終體積相等。細胞放入37℃、體積分數(shù)為5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，除空白對照組外，其余組均照射UVA，照射劑量為10 mJ/cm2，照射垂直距離為10 cm。

1.2.4 CCK8法檢測細胞存活率 選用對數(shù)生長期的貼壁成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液后，將細胞密度調(diào)整為5×104個/mL，每孔接種100 μL的細胞懸液于96孔培養(yǎng)板中，置于5% CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)12 h。每孔加入不同濃度染料木素，每組5個復孔，對照組加入相同體積培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2和飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 和24 h。終止培養(yǎng)前1 h，每孔加入100 μL CCK8溶液，混勻，在細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h后，于酶標儀上490 nm波長處檢測各孔的光密度OD值。

1.2.5 細胞凋亡檢測 細胞經(jīng)不同濃度染料木素處理并接受UVA照射后18 h，檢測細胞凋亡率。采用流式細胞儀檢測：用PBS洗滌，離心收集細胞(1000 r/min，5 min)，棄上清，用緩沖液重新懸浮細胞，細胞計數(shù)后將濃度調(diào)整到1×106個/mL，按照Annenxin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作規(guī)程檢測細胞凋亡率。用流式細胞儀檢測熒光強度。用專用Cell Quest軟件將所得數(shù)據(jù)采進行收集、儲存和分析各組HaCat細胞的凋亡率。

1.2.6 Sirt1mRNA表達量 細胞經(jīng)不同濃度染料木素處理并接受UVA照射后18 h，用RT-PCR法檢測Sirt1mRNA表達量，凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶Sirt1/GAPDH的灰度比值并進行統(tǒng)計分析。Sirt1及GAPDH引物序列、反應條件、擴增產(chǎn)物分子量見表1。

2 結(jié)果

2.1 染料木素對UVA照射后成纖維細胞增值活性的影響 染料木素對UVA照射后成纖維細胞增值活性的分析見圖1，表2。與A組比較,照射對照組細胞OD值明顯減少(P<0.05),說明UVA可明顯抑制成纖維細胞增殖活性，各實驗組間C～F組的細胞OD值明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明0.01 μmol/L～10 μmol/L的染料木素可以降低UVA對成纖維細胞增殖活性的抑制作用，其中D組與E組細胞OD值高于其他實驗組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 GAPDH為內(nèi)參Sirt1為目的引物序列

注：*其它組與B組比較:P<0.05

圖1 A～G為CCK8檢測UVA照射后各組成纖維細胞的OD值

2.1 染料木素對UVA照射后成纖維細胞凋亡率的影響 染料木素對UVA照射后成纖維細胞凋亡率結(jié)果分析見圖2，表2:與A組比較,照射對照組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05),C～F組的細胞凋亡率明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而B組與G組比較，細胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各實驗組中E組凋亡率最低, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 染料木素對UVA照射后成纖維細胞Sirt1mRNA表達的影響 各組均有Sirt1mRNA的表達，GAPDH對照均出現(xiàn)明顯擴增條帶，表明各組細胞中RNA的質(zhì)量及RT-PCR過程均良好，各組Sirt1/GAPDH相對表達量見表1，圖3。與A組比較照射組B～G組表達量增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各實驗組中，與B組比較，C～F組表達量增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中E組表達量最多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 染料木素對UVA照射后成纖維細胞凋亡率及OD值的影響

注：▲與A組比較:P<0.05；*與B組比較:P<0.05；○與C組比較:P<0.05；#與D組比較:P<0.05；◆與E組比較:P<0.05；+與F組比較:P<0.05；☆與G組比較:P<0.05

圖2 a～g為流式細胞儀檢測A～G組成纖維細胞凋亡的結(jié)果

圖3 各組PT-PCR擴增電泳結(jié)果

3 討論

皮膚作為人體最大的感覺器官，又是預防機械、物理、化學損傷及微生物感染的第一道防線[9]，在機體調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，同時皮膚的活性與美感直接影響人體日常生活和身心健康，因而預防紫外線對皮膚的光損傷是近年來皮膚研究領域中的熱門課題。UVA屬于長波紫外線，具有較強的穿透能力，能穿過表皮到達真皮引起膠原成分的減少和異常彈力纖維沉積，引起真皮成纖維細胞DNA損傷、氧化應激、細胞凋亡。

“人類長壽基因”SIRT1是一種NAD+依賴的去乙酰化酶類，參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，如基因沉默、機體生長、能量代謝、生物周期節(jié)律、新陳代謝等。近期研究表明，SIRT1可通過調(diào)節(jié)自噬系統(tǒng)或保護端粒長度對皮膚光老化起保護作用[10]，同時可以通過組蛋白/非組蛋白去乙酰化的作用發(fā)揮其抗氧化應激、抗炎、抑制細胞凋亡等作用[11]。P53基因是一種抑癌基因，在發(fā)生DNA損傷時被激活的P53蛋白表達增加，抑制周期蛋白激酶的活性，使細胞周期停滯于G1期[12]。SIRT1能與P53底物緊密結(jié)合，同時使P53蛋白的382位賴氨酸發(fā)生去乙酰化，阻礙P53基因的表達[13]，從而抑制細胞的凋亡。

研究表明雌激素受體β已成為皮膚光損傷新的治療靶點[15]，染料木素是一種大豆異黃酮類植物雌激素，其化學結(jié)構(gòu)與17-β雌二醇相似，能與雌激素受體β結(jié)合，通過抑制炎癥因子、金屬蛋白酶及cox2的活性而使皮膚減少或避免光損傷。此外，染料木素可減少脂質(zhì)過氧化物及硝基酪氨酸，促進細胞增殖和DNA的修復[16]。

本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，照射對照組成纖維細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，凋亡率明顯增加(P<0.05)，成纖維細胞Sirt1mRNA表達量明顯增加(P<0.05)，表明UVA照射成纖維細胞后可抑制細胞增殖導致細胞凋亡率、Sirt1mRNA表達量增加，驗證了SIRT1光保護作用。相對于照射對照組，C～F組細胞增值活性明顯升高，Sirt1mRNA表達明顯增多，而細胞凋亡率明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明染料木素可能通過調(diào)控SIRT1基因從而抑制細胞凋亡，這與染料木素對缺血/再灌注腎損傷保護機制的研究結(jié)果相似[16]。目前染料木素調(diào)控SIRT1基因機制仍不明確，Hsu等[17]等研究者發(fā)現(xiàn)染料木素可能通過增加腺苷酸活化蛋白激酶的活性從而刺激SIRT1基因的表達。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)染料木素在0.01 μmol/L～10 μmol/L濃度內(nèi)可降低UVA對成纖維細胞增殖活性的抑制作用，增加Sirt1mRNA的表達量，降低UVA所致成纖維細胞的凋亡率，說明染料木素在一定濃度內(nèi)對UVA具有防護作用。

綜上所述，我們認為染料木素在一定濃度內(nèi)(0.01 μmol/L～10 μmol/L)對UVA致成纖維細胞急性光損傷有防護作用，其作用機制可能與調(diào)控成纖維細胞Sirt1mRNA的表達水平有關。

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