根痛平片微生物限度檢查方法研究

姬 俊 ，牛萌萌 ，劉彩娜 ，王立云

（1．山東省青島市食品藥品檢驗研究院，山東 青島 266073； 2．山東省醫學科學院 山東省眼科研究所 青島眼科醫院，山東 青島 266071）

根痛平片是由伸筋草、白芍、燙狗脊、續斷、地黃、紅花、醋乳香、醋沒藥、桃仁、牛膝、葛根、甘草制成的中成藥，方中白芍、紅花、桃仁、乳香、沒藥為君藥[1]，功能主治活血、通絡、止痛，用于風寒阻絡所致頸椎病，癥見肩頸疼痛、活動受限、上肢麻木等[2]。目前，全國有4家藥品生產企業有批準文號。根據2015年版《中國藥典(四部)》通則1105和1106的非無菌產品微生物限度檢查的相關方法[3]，本研究中對3家企業的根痛平片進行了微生物限度方法適用性試驗，建立了適用于該產品的微生物限度檢查方法?，F報道如下。

1 儀器與材料

1．1 儀器

INE500型電熱恒溫培養箱（德國美墨爾特公司）；H·SWX-600BS型電熱恒溫水溫箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；SHP-160E型生化培養箱（上海三發科學儀器有限公司）；PYX-DHS-40×50型隔水式培養箱（上海躍進醫療器械廠）；TD型電子天平（浙江省余姚市金諾天平儀器有限公司）。

1．2 材料

培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為3105660），胰酪大豆胨液體培養基（批號為3105589），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為3104045），沙氏葡萄糖液體培養基（批號為 3104833），麥康凱瓊脂培養基（批號為3303011），麥康凱液體培養基（批號為 3104618），腸道增菌液體培養基（批號為3104849），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號為3104750），RV沙門增菌液體培養基（批號為3104847），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號為3104652），均由廣東環凱微生物科技有限公司提供，均符合2015年版《中國藥典》培養基適用性檢查的規定。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F） 98 001]、 黑 曲 霉 （Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]、 大 腸 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、乙 型 副 傷 寒 沙 門 菌 （Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50 094]為傳代不超過 5 代的菌種，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

試藥：根痛平片（承德燕峰藥業有限責任公司＜ A 廠 ＞，規格為每片 0．3 g，批號分別為 16914014，16914024，16914025；海口市制藥廠有限公司 ＜B廠＞，規 格 為 每 片 0．3 g， 批 號 分 別 為 160701， 160803，161201；北京斯利安藥業有限公司＜C廠＞，規格為每片0．5 g，批號分別為 GP170302，GP170303）。卵磷脂（青島高科園海博生物技術有限公司，批號為20170302）；聚山梨酯80（天津市富宇精細化工有限公司，批號為20151014）。

2 方法與結果

2．1 菌液制備

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1105，1106要求制備：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌接種于胰酪大豆胨液體培養基，于30～35℃培養24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養基中，于20～25℃培養3 d；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，于20～25℃培養7 d。取上述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用0．9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取上述黑曲霉的新鮮培養物加入 5 mL含 0．05%聚山梨酯 80的0．9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子，將菌懸液吸至無菌試管中，用含0．05%聚山梨酯80的0．9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2．2 供試液制備

取供試品10 g，以胰酪大豆胨液體培養基為稀釋液，加稀釋液制成1∶10供試液（不含中和劑），取此1∶10供試液（不含中和劑）用胰酪大豆胨液體培養基梯度稀釋制成 1∶100，1∶1 000供試液 1（不含中和劑）。取供試品10 g，以含3%聚山梨酯80和0．3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養基（以下簡稱含中和劑的稀釋液）為稀釋液，加此含中和劑的稀釋液制成1∶10供試液（含中和劑），取此1∶10供試液（含中和劑）用含中和劑的稀釋液梯度稀釋制成1∶100，1∶1 000供試液2（含中和劑）。

2．3 計數方法適用性試驗

試驗組：采用平皿法，取2．2項下供試液1，2各9．9 mL分別置于無菌試管中，在試管中分別加入2．1項下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各0．1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量≤100 cfu，取上述含有菌液的供試液1 mL注入平皿中，立即傾注15～20 mL熔化的瓊脂培養基（溫度不超過45℃）。菌液對照組：取胰酪大豆胨液體培養基替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌進行試驗。供試品對照組：取相應的供試液，用相應稀釋液代替菌液，照試驗組方法進行試驗。中和劑對照組：取相應的含中和劑的稀釋液代替供試品，照試驗組方法進行試驗。各組平行制備2個平皿，用于需氧菌計數的平皿使用胰酪大豆胨瓊脂培養基，于30～35℃培養；用于霉菌和酵母菌計數的平皿使用沙氏葡萄糖瓊脂培養基，于20～25℃培養。

2．4 計算

供試品試驗組的回收結果＝（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）／菌液對照組的平均菌落數；稀釋劑對照組的回收結果＝稀釋劑對照組的平均菌落數／菌液對照組的平均菌落數。結果見表1至表2。可見，中和劑能降低根痛平片對枯草芽孢桿菌的抑菌作用，使所選的3家企業的8批樣品稀釋到1∶100時對枯草芽孢桿菌的回收結果均為0．5～2，符合藥典要求。由表2可知，稀釋劑對照組回收結果為0．5～2，分別對3家企業的藥品進行計數方法適用性試驗，結果都符合藥典要求?？捎煤泻蛣┑囊壤掖蠖闺艘后w培養基制備供試液，取1∶100供試液（含中和劑）按照平皿法進行根痛平片的微生物限度的計數檢查。

2．5 控制菌檢查方法適用性試驗

2．5．1 大腸埃希菌

試驗組：取2．2項下1∶10供試液（不含中和劑）10mL和菌量≤100 cfu的大腸埃希菌接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中。陽性對照試驗組：取菌量≤100 cfu的大腸埃希菌接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中。供試品對照組：取 2．2項下1∶10供試液（不含中和劑）10 mL至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中。陰性對照試驗組：取胰酪大豆胨液體培養基10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中。以上各組于30～35℃培養24 h后，分別取上述各組培養物1 mL接種于麥康凱液體培養基中，42～44℃培養48 h。將其培養物分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，30～35℃培養 72 h。

表1 根痛平片對枯草芽孢桿菌的計數方法適用性試驗結果

表2 根痛平片微生物計數方法適用性試驗結果

2．5．2 耐膽鹽革蘭陰性菌

預培養：取 2．2項下 1∶10，1∶100，1∶1 000 供試液（不含中和劑）10 mL置于無菌試管中，于20～25℃培養 2 h。試驗組：分別取以上 1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1 000 供試液1 mL和菌量≤100 cfu的大腸埃希菌接種或銅綠假單胞菌至10 mL腸道增菌液體培養基中。陽性對照試驗組：取菌量≤100 cfu的大腸埃希菌或銅綠假單胞菌接種至10 mL腸道增菌液體培養基中。供試品對照組：分別取以上 1∶10，1∶100，1∶1 000供試液 1 mL 至 10 mL腸道增菌液體培養基中。陰性對照試驗組：取胰酪大豆胨液體培養基1 mL接種至10 mL腸道增菌液體培養基中。以上各組于30～35℃培養48 h后，將上述各組培養物接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養24 h。

2．5．3 沙門菌

試驗組：取供試品10 g和菌量≤100 cfu的沙門菌接種至200 mL胰酪大豆胨液體培養基中。陽性對照試驗組：取菌量≤100 cfu的沙門菌接種至200 mL胰酪大豆胨液體培養基中。供試品對照組：取供試品10 g至200 mL胰酪大豆胨液體培養基中。陰性對照試驗組：200 mL胰酪大豆胨液體培養基。以上各組于30～35℃培養24 h后，分別取上述各組培養物0．1 mL接種于RV沙門增菌液體培養基中，30～35℃培養24 h。將其培養物分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，30～35℃培養48 h。結果見表3?？梢姡囼灲M檢出陽性菌，供試品對照組和陰性對照試驗組均為陰性。因此，可按以上控制菌的檢查方法對大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌進行檢驗。

表3 控制菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

根痛平片由12味中藥制成，除部分白芍粉碎成細粉直接混合制粒，其他中藥均經水煎煮。研究表明，白芍、紅花、伸筋草、狗脊、乳香、牛膝的水提物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有不同程度的抑制作用[4-9]。預試驗結果顯示，根痛平片對藥典中用于方法適用性試驗要求的枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯強于其余4種菌。因此，首先篩選出能消除根痛平片對枯草芽孢桿菌的方法，進而確定根痛平片的菌落計數方法。

考察常規平皿法時，采用不同稀釋條件，對枯草芽孢桿菌進行回收試驗。結果只有北京斯利安藥業有限公司的供試品在1∶50稀釋級能使回收符合要求，其他2家的供試品在1∶100稀釋級的回收結果均小于0．5。聚山梨酯80和卵磷脂聯用能降低藥物的抑菌作用[10-11]，故采用這2種中和劑來消除成分復雜的根痛平片的抑菌作用。使用含中和劑的稀釋劑制備供試品，需要制備成1∶100供試液，才能使3家企業的供試品對枯草芽孢桿菌的回收均為0．5～2，符合藥典要求。

綜上，平皿法和中和劑聯用能消除根痛平片對枯草芽孢桿菌的抑制，可為其微生物限度檢查方法提供參考。

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