微滴數字PCR技術在多拷貝木聚糖酶釀酒酵母工程菌篩選中的應用

蘭 雪，張斯童，李 哲，常 浩，孫 旸，王 剛，陳 歡，王春鳳，陳 光,*

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它不僅在能源工業上可發揮巨大作用，在飼料、造紙、食品等領域也有著廣闊的應用前景[1-2]。而制約我國木聚糖酶生產與應用的主要限制性因素是缺乏能夠與規?；a相適應的高產菌株，因此，開發出具有我國自主知識產權的高產木聚糖酶新菌系迫在眉睫[3]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是美國食品與藥品管理局認定的一種安全菌株，是食品與飼用酶制劑表達的理想宿主[4]。釀酒酵母生物學和遺傳學背景清楚，既具有原核生物生長繁殖快、遺傳操作簡單的特點，又具有真核生物對外源蛋白進行翻譯后修飾加工的能力。近年來，在外源基因表達方面得到了深入研究和廣泛應用[5-6]。rDNA序列是指細胞核中編碼核糖體RNA的DNA序列，它是一段高度重復序列，其重復單位由轉錄區段和非轉錄區段組成。在釀酒酵母的XII染色體中，rDNA存在100～140 個重復單位[7]。如果以釀酒酵母rDNA序列為整合位點，從理論上說，可以得到100～140 個目的基因拷貝數。依賴于rDNA介導整合的外源基因導入釀酒酵母后，外源基因在酵母細胞內的表達會由于劑量效應而實現高效表達[8]。但研究發現，基因拷貝數在一定的范圍內與蛋白表達量成正相關，通常在4～9 拷貝左右，超過這個范圍，蛋白表達水平反而降低[9-10]。

微滴數字聚合酶鏈式反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是近年來興起的一種新的基因絕對定量技術，通過極度稀釋實現理論上的單分子擴增，然后用終點法PCR和泊松分布計算出樣品的原始濃度，具有良好的準確度和重現性，可以實現真正意義上的絕對定量[11-12]。

本研究利用rDNA整合法構建多拷貝木聚糖酶釀酒酵母工程菌，并利用ddPCR技術對其拷貝數進行定量分析，并對不同拷貝數轉化子產木聚糖酶活力進行測定，探討基因拷貝數和酶活力之間的關系，以期為木聚糖酶生產菌株的構建和改造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichaa coli）DH5α為吉林農業大學生物物理研究室保存菌種；黑曲霉CICC2462菌株中國工業微生物菌種保藏中心；釀酒酵母INVSc1（MATa、his3、leu2、trp1、ura3）、質粒pYES2（圖1）中國工業微生物質粒菌種保藏中心；pMD19-T 日本TaKaRa公司。

圖1 pYES2質粒圖譜Fig. 1 Map of plasmid pYES2

反轉錄試劑盒、去磷酸化試劑盒、限制性內切酶（NotI、XbaI、SnaBI等）、T4連接酶、SD-Ura培養基 日本TaKaRa公司；Salmon Sperm DNA 上海源葉生物科技有限公司；質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限責任公司；酵母基因組提取試劑盒 美國Omega公司；ddPCR EvaGreen Supermix、Droplet reader oil 美國Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒 美國Axygen公司；木聚糖美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

QX200型ddPCR儀、Universal hood III全能發光系統、電泳儀 美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 xynB基因克隆

1.3.1.1 黑曲霉CICC2462總RNA提取

將黑曲霉CICC2462菌種經平板活化后，制備種子液，將種子液接種于液體發酵培養基，30 ℃、150 r/min培養72 h后，收集菌體，用總RNA提取試劑盒提取RNA[13]。

1.3.1.2 引物設計

根據美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中黑曲霉木聚糖酶基因序列，用Primer 5.0設計引物擴增xynB基因，并引入酶切位點NotI和XbaI。上游引物F1：5’-ATTTGCGGCCG CCTAGAGAGCATTTGCGATAGC-3’，下游引物R1：5’-TG CTCTAGAATGGTTCAGATCAAGGTAGCTG-3’。

1.3.1.3 xynB基因擴增

以提取的黑曲霉總RNA為模板，用TaKaRa一步法反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板擴增xynB基因，擴增條件見TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0說明書。瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化目的條帶[14]。

1.3.1.4 克隆載體的連接、轉化、鑒定

將回收產物與pMD19載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，接種到含有氨芐青霉素（ampicillin，Amp）的抗性平板上篩選。12 h后挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆于含有Amp抗性的LB液體培養基37 ℃、160 r/min培養。12 h后離心收集菌體，提取質粒并送測序，命名為pMD19-T-xynB。

1.3.2 rDNA序列擴增

1.3.2.1 酵母菌的培養以及DNA提取

用YPD固體培養基劃線培養釀酒酵母INVSc1，挑取單克隆，YPD液體培養2 d后，收集菌體，用OMEGA酵母基因組提取試劑盒，提取DNA[15]。

1.3.2.2 引物設計及rDNA基因擴增

根據NCBI數據庫中的信息，用Primer 5.0設計引物擴增2 300 bp的rDNA核心序列，并引入酶切位點SnaBI。上游引物F2：5’-ACGTACGTACAACGAACGAGACCTT AACCT-3’，下游引物R2：5’-ACGTACGTACGGAACCT CTAATCATTCGCT-3’。以釀酒酵母基因組為模板，擴增rDNA序列，擴增條件為：94 ℃預變性180 s；94 ℃變性10 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸150 s；循環數為30，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化目的條帶。

1.3.2.3 克隆載體的連接、轉化、鑒定

方法同1.3.1.4節，命名為pMD19-T-rDNA。

1.3.3 表達載體pYES2-xynB-rDNA的構建

用NotI和XbaI分別酶切載體pMD19-T-xynB和pYES2，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉化DH5α，Amp抗性篩選后經xynB菌液PCR鑒定得到質粒pYES2-xynB，測序驗證后，用SnaBI對載體pYES2-xynB和pMD19-T-rDNA進行酶切，對回收的pYES2-xynB片段進行去磷酸化后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉化DH5α。12 h后挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，挑取陽性克隆于含有Amp抗性的LB液體培養基37 ℃、160 r/min培養。12 h后離心收集菌體，提取質粒酶切鑒定，命名為pYES2-xynB-rDNA。

1.3.4 線性化pYES2-xynB-rDNA載體轉化釀酒酵母

用SphI在rDNA位置對pYES2-xynB-rDNA進行單酶切，經瓊脂糖凝膠回收后，用 LiAc/SS載體DNA/PEG化學轉化法轉化感受態釀酒酵母[16-17]，轉化體系為：感受態釀酒酵母，50 μL；50% PEG3350，240 μL；1 mol/L LiAc，36 μL；2 mg/mL boiled carrier DNA，50 μL；Plasmid DNA，34 μL。經42 ℃孵育后，將細胞重懸于1 mL YPD液體培養基中，30 ℃、150r/min培養1 h，收集菌體，用200 μL ddH2O重懸菌體后，將其涂布與SD-Ura平板，30 ℃培養3～5 d直至出現單菌落。對挑取的單菌落進行xynB的菌液PCR驗證。

1.3.5 ddPCR鑒定轉化子拷貝數

1.3.5.1 引物及探針

對得到的陽性轉化子，接種于YPD培養基中，培養48 h后，收集菌體，用真菌總RNA提取試劑盒提取釀酒酵母RNA，經TaKaRa RNA PCR Kit （AMV） Ver.3.0反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，ATC1基因為內參，利用ddPCR進行xynB基因拷貝數鑒定[18-19]。引物探針序列為：ATC1上游引物F3：5’-ATC1TATCCCCTGCATCCCTATCA-3’，下游引物R3：5’-CAGGCTTCGTTGCAGATACA-3’，探針：5’-HEXCATCTTCGTTAGCTTCATCCGACGCTA-BHQ-3’；xynB上游引物F4：5’-GCCGTGGACAGTTCTCTTTC-3’，下游引物R4：5’-TCATGACCCCGATGAGTGTA-3’，探針：5’-FAM-CCTGGTCAACTTTGCCCAGTCTAACAABHQ-3’。內參基因熒光標記基團為HEX，目的基因熒光標記基團為FAM。

1.3.5.2 ddPCR體系和條件

ddPCR包括配制體系、生成微滴、擴增循環和信號讀取4 個步驟。ddPCR體系為20 μL，包含10 μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol/L 正向引物和反向引物各1 μL、探針0.5 μL，DNA模板2 μL。生成微滴需要使用專門的微滴生成卡和微滴生成儀，將40 μL PCR體系和70 μL微滴生成油（droplet generation oil）加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴。ddPCR擴增使用兩步法，設置程序如下：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共45 個循環，擴增結束后進行98 ℃、10 min的熱失活。每個模板重復3 個平行檢測。擴增結束后，將96 孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，并使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0分析分析實驗數據，獲得絕對定量結果[20-22]。

1.3.6 轉化子發酵產酶實驗

將1.3.5節鑒定得到的不同拷貝數的轉化子接種至半乳糖培養基中，30 ℃、150 r/min培養72 h后，取上清液，用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定木聚糖酶活力，具體方法見文獻[23-24]，木糖標準曲線回歸方程為：y=0.127 5x－0.07，R2=0.993 5。

1.3.7 高酶活轉化子產酶穩定性實驗

將1.3.6節得到的產酶活力最高的轉化子接種于半乳糖培養基中，進行傳代，每次傳代均在30 ℃、150 r/min培養72 h后，取上清液測定木聚糖酶活力，連續傳代8 次。

2 結果與分析

2.1 xynB基因和rDNA序列的克隆

以提取的黑曲霉CICC2462總RNA為模板，經TaKaRa一步法反轉錄試劑盒得到cDNA，用引物F1和R1擴增得到預期目的片段，大小為984 bp。以釀酒酵母基因組為模板，用引物F2和R2擴增得到rDNA基因片段，大小約為2 300 bp。擴增產物大小均符合預期，如圖2所示。

將上述基因擴增片段分別與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證后，提取質粒，經NotI和XbaI酶切后，得到載體片段和xynB基因片段。用SnaBI酶切后，得到預期rDNA片段，如圖3所示。將測序結果與GenBank（登錄號：FJ_986225.1 和BK_006945.2）序列進行比對，相似度100%，表明xynB基因和rDNA未發生堿基突變。

圖2 xynB和rDNA片段的PCR擴增Fig. 2 PCR amplification of xynB and rDNA fragment

圖3 克隆載體pMD19-T酶切鑒定Fig. 3 Restriction enzyme digestion of recombinant vector pMD19-T

2.2 表達載體pYES2-xynB-rDNA的構建

圖4 表達載體的酶切鑒定Fig. 4 Restriction enzyme digestion of expression vector

用NotI和XbaI分別酶切載體pMD19-T-xynB和pYES2，回收目的片段后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉化DH5α，經xynB菌液PCR鑒定得到質粒pYES2-xynB，測序驗證后，用SnaBI對載體pYES2-xynB和pMD19-T-rDNA進行酶切，對回收的pYES2-xynB片段進行去磷酸化后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉化DH5α，菌液PCR驗證后，提取質粒酶切驗證，結果如圖4所示，pYES2載體大小為5 864 bp；pYES2-xynB載體大小為6 848 bp；pYES2-xynB-rDNA大小為9 148 bp。

2.3 轉化子拷貝數的ddPCR檢測結果

用SphI在rDNA位置對pYES2-xynB-rDNA進行線性化后，轉化感受態釀酒酵母INVSc1，對經SD-Ura培養基篩選得到的陽性轉化子提取RNA，反轉錄為cDNA后，使用ddPCR進行轉化子拷貝數檢測。圖5顯示的結果為在2 個檢測通道下，檢測的陽性微滴和陰性微滴的分布轉框，圖中陽性微滴和陰性微滴區分明顯，系統可準確判讀出陽性微滴和陰性微滴數目[25]。

圖5 ddPCR測定轉化子拷貝數Fig. 5 Detection of copy number of transformants by ddPCR

微滴生成是ddPCR的關鍵步驟，只有微滴數大于10 000時，DNA分子的分布才能符合泊松分布的統計學原理，系統才可以對陽性和陰性微滴進行計數。ddPCR擴增形成的微滴數如表1所示。由表1可知，反應中形成的微滴數處于11 411～15 859之間，均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求[26-28]。根據軟件讀取的各轉化子xynB基因和ATC1基因的濃度，得出目的基因xynB的拷貝數。ddPCR分析顯示，利用rDNA整合法，成功獲得了1、2、3、5、9、10、14、16、17和18共10 種不同拷貝數的轉化子。

表1 ddPCR拷貝數分析結果Table 1 Estimated copy number of transformants by ddPCR

2.4 不同拷貝數轉化子發酵產木聚糖酶活力分析

對10 株攜帶不同拷貝數的菌株，通過搖瓶發酵培養，經過半乳糖誘導72 h后，取發酵液進行木聚糖酶活力測定，不同拷貝數轉化子木聚糖酶活力如圖6所示，當xynB拷貝數小于9時，木聚糖酶活力隨著拷貝數增加而增加，9 拷貝時木聚糖酶活力最高為308 U/mL，是單拷貝時的5.4 倍；超過9 拷貝后，木聚糖酶活力降低，到18 拷貝時，酶活力僅為9 拷貝時的44%。

圖6 拷貝數與酶活力之間的關系Fig. 6 Relationship between copy number and enzymatic activity

2.5 轉化子產酶穩定性分析

對得到的酶活力最高的9 拷貝轉化子，進行遺傳穩定性研究，結果如圖7所示，結果表明，用rDNA整合法獲得的轉化子產酶穩定性較好，經過8 次傳代后，酶活力變化微小，第8次傳代時酶活力為310 U/mL。

圖7 傳代次數與酶活力之間的關系Fig. 7 Relationship between passage number and enzymatic activity

3 討論與結論

外源基因的拷貝數是影響外源蛋白高效表達的一個重要因素。大量研究表明，增加基因的拷貝數可以有效增加外源蛋白的表達[29-30]。近年來，隨著現代分子生物學技術的發展，研究人員采取了多種策略來提高外源基因的拷貝數[31]，如串聯表達盒法等，但這種方式需要頻繁地構建載體、酶切、純化回收 DNA 片段，操作繁瑣，且需要消耗大量的酶來制備線性化片段。本研究利用釀酒酵母12號染色體上rDNA多拷貝重組位點作為構建多拷貝工程菌的方法，高效而且簡單方便，篩選得到最多18拷貝的轉化子。但對于分泌表達來說，外源基因的劑量固然是一個重要的因素，但蛋白的翻譯、內質網內蛋白折疊和加工、分泌途徑同樣會影響外源蛋白的表達，高劑量的外源基因的表達可能會對菌體本身的生長帶來不利影響，因此，對于釀酒酵母的分泌型表達，并不是拷貝數越多越好，需要篩選得到最優拷貝數[32-33]。本研究利用rDNA整合法構建了釀酒酵母木聚糖酶工程菌，通過ddPCR技術鑒定得到了10 種不同拷貝數的菌株，對這些菌株產木聚糖酶的能力進行測定，發現當拷貝數小于9時，木聚糖酶活力與拷貝數呈正相關，在9 拷貝時達到最高，為308 U/mL；當拷貝數大于9時，木聚糖酶活力反而降低，到18 拷貝時，其產酶活力僅為9拷貝時的44%；對9 拷貝菌株的產酶穩定性進行研究，發現其在傳代8 次后，仍能保持產酶穩定，說明用rDNA整合法得到的木聚糖酶釀酒酵母能穩定遺傳。

本實驗成功構建木聚糖酶rDNA整合表達載體，并整合到釀酒酵母基因組獲得10 株不同拷貝數的菌株，對其酶活力進行測定，發現當拷貝數小于9時，產酶能力隨拷貝數增加而增強，9 拷貝菌株產酶能力最強，酶活力為308 U/mL，超過9 拷貝，產酶能力降低。

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