鹽酸四環素胃內漂浮微球的研制

鐘磊 卞芳 趙朝陽 張洪

[摘要] 目的 采用離子膠凝法制備鹽酸四環素胃內漂浮微球，改善其胃內釋藥及抗幽門螺旋桿菌治療時的療效。 方法 選用殼聚糖及海藻酸鈉為載體，以NaHCO3為起泡劑；通過正交試驗考察海藻酸鈉與藥物用量比、殼聚糖濃度、CaCl2濃度、海藻酸鈉與NaHCO3用量比等對其體外漂浮性能、體外釋放、包封率、成球性的影響，篩選出最佳工藝。 結果 最優工藝條件：殼聚糖濃度為8 mg/mL，海藻酸鈉與藥物比例為4∶1，CaCl2濃度為20 mg/mL，海藻酸鈉與NaHCO3比例為2∶1，所制備的鹽酸四環素胃內漂浮12 h微球漂浮率為95%，包封率為79.90%，形態良好，體外試驗具備緩釋性。 結論 該鹽酸四環素胃內漂浮微球達到了胃內滯留要求，可提高吸收及抗幽門螺旋桿菌療效，減少口服給藥次數，可解決現有上市劑型的不足。

[關鍵詞] 鹽酸四環素；胃內漂浮微球；殼聚糖；海藻酸鈉；正交試驗

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0023-04

[Abstract] Objective To prepare Tetracycline Hydrochloride gastric floating microspheres using ionic gelation method， and to improve drug release percentage and therapeutic effect of anti-Helicobacter pylori. Methods Chitosan and alginate were chosen as the carriers， and NaHCO3 was utilized as the foaming agent. The orthogonal experiment was adopted to investigate the weight ration of tetracycline/alginate and alginate/NaHCO3， as well as the concentration of CaCl2 and chitosan. Therefore， the optimum preparation was determined by evaluating floating performances， drug release， encapsulation efficiency and balling index. Results The optimal conditions were as followed： the concentration of chitosan was 8 mg/mL， the weight ration of alginate/tetracycline was 4∶1， the concentration of CaCl2 was 20 mg/mL， and the weight ration of alginate/NaHCO3 was 2∶1. The microcapsules could float in stomach for 24 h with a floating rate of 95%， and the encapsulation efficiency was 79.90%. The in vitro experiments suggested that these floating microspheres had good sustain-release properties. Conclusion According to the results above， tetracycline gastric floating microspheres meet the requirements of gastric retention， which can increase drug absorption and therapeutic effect of anti-Helicobacter pylori， reduce dosing frequency， and have more selection of dosage forms.

[Key words] Tetracycline Hydrochloride； Gastric floating microspheres； Chitosan； Alginate； Orthogonal experiment

四環素是菲烷母核的廣譜抗生素，抑制細菌蛋白合成，廣泛應用于革蘭陽性和陰性細菌感染。目前仍為立克次體感染、支原體感染、衣原體感染、螺旋體感染首選藥物，同時因其耐藥率較低，為抗幽門螺旋桿菌根除四聯方案一線推薦藥物[1-5]。四環素具有抑制基質金屬蛋白酶活性、減少骨吸收、恢復成骨細胞的功能及結構、降低可誘導氮氧化物合成酶表達及其他前炎性細胞素等，體外可促進人胚成骨細胞的增殖及活性，促進Ⅰ型膠原、骨鈣素等合成，目前其無抗菌活性異構體已用于觀察治療骨膠原分解過度的疾病[6]。四環素呈酸性，1%鹽酸四環素溶液pH值為1.8～2.8[7]，堿性環境下發生降解失活，中性環境下可與金屬離子生成不溶性螯合物，弱酸性環境發生差向異構化生成無抗菌活性異構體，口服僅有30%～40%經胃腸道吸收[8-9]。將鹽酸四環素制成胃內漂浮微球后可使其長時間滯留在胃內，提高胃內藥物濃度，改善吸收，減少服藥頻次，尤其能提高胃幽門螺旋桿菌的清除率。海藻酸鈉與氯化鈣、殼聚糖經電解質聚合后生成復合物[10-11]。殼聚糖可使海藻酸鈣骨架的網眼堵塞，使制劑的穩定性提高并增加載藥量，調整藥物的釋放速率[12-14]。本研究以鹽酸四環素為原料，載體選用殼聚糖/海藻酸鈉，選用離子膠凝法為制備方法，對處方及工藝進行研究。

1 儀器與材料

Cary100紫外-可見分光光度計（美國Varian）；XS105DU電子天平（Mettler Toledo公司）；HH-1電熱恒溫水浴鍋（北京市科偉永興儀器有限公司）；RE-2000旋轉蒸發儀（上海越眾儀器設備有限公司）；HL-C2000真空干燥箱（上海市華連醫療器械有限公司）；電子掃描顯微鏡（美國Amray）。

鹽酸四環素藥物（武漢遠城科技發展公司，批號：151108-62）；鹽酸四環素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：150486-200403）；殼聚糖（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150710）；海藻酸鈉（青島晶巖生物科技開發有限公司，批號：20150519）；NaHCO3（天津致遠化學試劑有限公司，批號：20150707）；無水氯化鈣（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20151116）；稀鹽酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 鹽酸四環素的測定

目前四環素含量測定有微生物法、分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、差示導數光譜法、差示分光光度法等[15-17]。本研究選用差示分光光度法，以蒸餾水為溶劑，取四環素標準品配置成0.2 mg/mL溶液，在300～500 nm波長范圍掃描，測得四環素最大吸收波長為396 nm，同時做海藻酸鈉及殼聚糖掃描，發現在此波長無吸收，對四環素測定無干擾。取不同濃度四環素標準液，分兩組各加入0.01 mol/L稀鹽酸、0.001 mol/L氫氧化鈉。將酸性液作為參比，以堿性液為樣品液，在396 nm處測得吸光度差值。繪制標準曲線，回歸方程為Y = 0.0293X + 0.0102（r = 0.9973），線性范圍：0.6～32 μg/mL。取鹽酸四環素胃內漂浮微球研碎，稱取粉末0.1 g加入100 mL量瓶，振蕩溶解，微孔濾膜過濾，取濾液依前法396 nm處測定吸光度，代入標準曲線計算鹽酸四環素含量。

2.2 制備工藝

取鹽酸四環素原料加入5 mL蒸餾水中，攪拌混勻，取適量的海藻酸鈉和微晶纖維素（作為惰性成分，延緩藥物釋放）加入鹽酸四環素溶液中，超聲溶解5 min，得到混合溶液1。取一定比例稀鹽酸、殼聚糖及無水氯化鈣加入20 mL蒸餾水中，攪拌均勻后得到混合溶液2。將混合溶液1經注射器滴入混合溶液2中，2 min后加入一定量的NaHCO3，攪拌至15 min，過濾后蒸餾水清洗2次，放入真空干燥箱干燥（45℃），得到鹽酸四環素胃內漂浮微球。

2.3 漂浮率測定

在100 mL模擬胃液中放入微球，以100 r/min、（37±0.5）℃下恒溫攪拌12 h后統計漂浮微球的數量。計算公式：漂浮率=12 h后漂浮微球數量/總微球數量×100%。

2.4 包封率及載藥量的測定

取0.2 g的四環素微球，研碎，加入10 mL的蒸餾水溶液超聲溶解后加入量瓶，稀釋到50 mL，混勻后經微孔濾膜過濾，取濾液2 mL，按前法測定其含量。計算公式：包封率=微球中鹽酸四環素質量/投入鹽酸四環素總質量×100%，載藥量=微球中的鹽酸四環素質量/載體總質量×100%。

2.5 體外釋放度測試

模擬胃內生理環境，選擇人工胃液為介質進行鹽酸四環素胃內漂浮微球釋放度測定。試驗采用溶出度測定法，按載藥量精密稱取250 mg的微球，加入溫度為（37.0±0.5）℃的人工胃液1000 mL，以100 r/min的速度攪拌，每隔1 h取樣5 mL，同時補加5 mL人工胃液。樣品以微孔濾膜過濾，加入蒸餾水定容至50 mL，以差示分光光度法計算各時間點樣品液中鹽酸四環素含量，計算各時間點釋放率，繪制釋放曲線。

2.6 圓整度測定

將一塊光滑的玻璃平板置于水平臺面上，取一定數量的鹽酸四環素胃內漂浮微球置于玻璃平板上，測得的微球開始滾動時玻璃與水平臺面間夾角為圓整度指標，其值越小，圓整度越好。

2.7 優化制備工藝

將預試驗選定影響顯著的4個單因素（殼聚糖濃度、海藻酸鈉與藥物比例、CaCl2濃度、海藻酸鈉與NaHCO3比例），經正交試驗優化并得到最佳處方。

2.7.1 實驗設計 將4因素A[殼聚糖濃度（mg/mL）]、B（海藻酸鈉與藥物比例）、C[CaCl2濃度（mg/mL）]、D（海藻酸鈉與NaHCO3比例）按L9（34）正交表進行實驗，見表1。

2.7.2 實驗結果 依預試驗及單因素試驗結果，選定圓整度、包封率、載藥率、12 h漂浮率為處方評價指標，按表1中4因素3水平進行試驗，實驗結果見表2。依表2中各水平組合得到結果，經綜合加權評分后進行數據分析，判斷各因素對微球性能的影響程度，確定最佳工藝。

2.7.3 結果處理 處方以圓整度（g）、包封率（F1）、載藥率（F2）、漂浮率（E）為評價指標，選用加權綜合評分方法對實驗數據進行分析。根據包封率、載藥率的數值及其重要程度，二者的加權綜合評分公式確定為F=F1+6F2，F值的權重定為1；漂浮率的權重值定為1；因圓整度值小，且對藥物的釋放存在影響，將其權重定為4。綜合加權評分T=E+F-4g，T值越高，微球的綜合性能越好。分析結果見表3。表3中R值越大，對結果的影響越高。可以得知各因素對微球的圓整度、包封率及載藥量、漂浮率的影響依次為D（海藻酸鈉與NaHCO3比例）>B（海藻酸鈉與藥物比例）>C（CaCl2濃度）>A（殼聚糖濃度），最佳的因素組合為A1B2C2D3。

2.8 重復性實驗

通過正交試驗篩選出最佳處方后，依最佳處方制備出三組鹽酸四環素胃內漂浮微球，分別測定圓整度、漂浮率、包封率。見表4。由表4可見該處方工藝制備出的微球質量穩定，成球形態、包封率及載藥率、漂浮性能均較好。另制備三組微球，依據“2.5”的方法測定鹽酸四環素在各時間點的累積釋放度，取其平均值繪制體外釋放曲線。見圖1。微球在第1小時釋放度為49.33%，其后藥物呈平穩釋放，第12小時的釋放度為95.60%。取微球在電子顯示鏡下觀察，形態學結果見圖2。

3 討論

殼聚糖不溶于水，加入稀鹽酸可提高其溶解度同時提升四環素的穩定性，起泡劑NaHCO3最終環節中加入，與混合液中的稀鹽酸反應快速釋放出CO2，CO2經包封入微球后可降低微球密度，獲得漂浮性能，故海藻酸鈉與NaHCO3用量比為處方工藝的關鍵。因四環素在強光及熱環境下不穩定，制備過程在陰涼環境中進行，提高了微球的質量穩定性。

本研究通過以正交試驗對各因素進行分析，得到了制備胃內漂浮微球的優化處方，經測試依此工藝制備的鹽酸四環素胃內漂浮微球具有較好的綜合性能和穩定性，為下一步劑型改進及臨床實驗打下了基礎。

海藻酸鈉為有生物相容性可降解線性鏈狀陰離子聚合物，無毒副作用[18]。在酸性條件下，分子中的自由羧基和羥基和CaCl2接觸后，Ca2+離子置換海藻酸鈉中的部分氫離子及鈉離子，形成凝膠，經固化后可形成微球。殼聚糖為天然的親水性多糖，是一種聚陽離子電解質[19]。海藻酸鈉與殼聚糖在電荷作用形成陰陽聚電解質[20]。本研究利用以上反應提高了胃內漂浮微球的包封率。

制備的微球第1個小時呈突釋現象，考慮為鹽酸四環素水中易溶，溶出速度快，加入的微晶纖維素水中難溶，形成的非水屏障不連續，導致鹽酸四環素通過凝膠層速度較快所致，接下來小組將進一步優化處方工藝，改進其緩釋性能。

微球體外試驗示其可在12 h內穩定釋藥，相比普通口服片劑的服藥頻次3次/d，本制劑服藥頻次可減少至2次/d，尤其在抗幽門螺旋桿菌治療組合方案中可與同組治療藥物用藥頻次保持一致，提高了患者的依從性，具有較好的臨床使用價值。

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