納米銀抗菌凝膠對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合及巨噬細(xì)胞數(shù)量和微血管密度的影響

張紫豪 高素玥 崔文浩

[摘要]目的：觀察納米銀抗菌凝膠聯(lián)合重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合、巨噬細(xì)胞數(shù)量以及微血管再生的影響。方法：選取健康SD大鼠114只（6只作為非燙傷正常對(duì)照組，不作任何處理），剩余SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組，rhGM-CSF組、聯(lián)合組和模型組，每組36只。制作深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型，rhGM-CSF組大鼠創(chuàng)面涂抹rhGM-CSF，聯(lián)合組應(yīng)用納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF涂抹，模型組不作任何處理。比較各組創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量以及微血管密度數(shù)量。結(jié)果：同一時(shí)間點(diǎn)，rhGM-CSF組和聯(lián)合組愈合率均高于模型組，且聯(lián)合組愈合率顯著大于rhGM-CSF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；聯(lián)合組第3、11、14天創(chuàng)面浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞數(shù)量均少于模型組和rhGM-CSF組（P<0.05）；第3、7、11天，聯(lián)合組微血管數(shù)量顯著高于模型組和rhGM-CSF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：納米銀抗菌凝膠聯(lián)合rhGM-CSF治療深Ⅱ度燙傷效果確切，可以通過(guò)影響燙傷創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量和微血管生成促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]納米銀抗菌凝膠；重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；燙傷；巨噬細(xì)胞；微血管

[中圖分類(lèi)號(hào)]R644 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）03-0104-04

Effect of Nano Silver Antibacterial Gel on the Deep Ⅱ Degrees of Rat Scalded Wound Healing and the Number of Macrophages， the Microvascular Density

ZHANG Zi-hao 1，GAO Su-yue2，CUI Wen-hao3

（1.Chinese PLA General Hospital，Beijing 100000，China；2.the Second Hospital Affiliated to Suzhou University，Suzhou 215004，Jiangsu，China；3.the First People's Hospital of Jinzhong，Jinzhong 030600，Shanxi，China）

Abstract： Objective To observe the effect of nano silver antibacterial gel joint rhGM-CSF on the deep Ⅱ degrees of rat scalded wound healing and the number of macrophages， the microvascular density. Methods A total of 114 healthy SD rats （6 rats served as non scald normal control group， without any treatment） were selected， the remaining SD rats were randomly divided into 3 groups， the rhGM-CSF group， the combination group and the model group， 36 rats in each group. The deep second degree scald wound model was made， the rhGM-CSF group was treated with rhGM-CSF， the combination group was treated with nano silver antibacterial gel and rhGM-CSF， and no treatment was given to rats of the model group. The rate of wound healing， the number of macrophages and the number of microvessel density in each group were compared. Results At the same time， the healing rate of the rhGM-CSF group and the combination group were higher than those of the model group， and the combination group was significantly higher than the rhGM-CSF group， the difference were statistically significant （P<0.05）. The number of macrophages in the combination group on the 3， 11， 14d were less than those of the model group and the rhGM-CSF group （P<0.05）. The number of microvessels in the combination group on the 3， 7， 11d were significantly higher than those of the model group and the rhGM-CSF group （P<0.05）. Conclusion The effect of nano silver antibacterial gel joint rhGM-CSF treatment was exact， and can promote the healing of scalded wounds by affecting the number and angiogenesis of burn wounds.

Key words： nanosilver antibacterial gel； recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor； burns； macrophages； microvascular

燙傷通常可造成人體皮膚組織損傷，形成燙傷創(chuàng)面，其中以深Ⅱ度燙傷最為常見(jiàn)，深Ⅱ度燙傷會(huì)損傷到真皮乳頭層以下到達(dá)真皮深層，臨床愈合情況變異系數(shù)較大，如果處理不當(dāng)就會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，血管生成延緩，進(jìn)而影響愈合。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的直觀指標(biāo)，CD68在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，常常被作為巨噬細(xì)胞的可靠標(biāo)記[1]。CD34是一種跨膜糖蛋白，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中能夠穩(wěn)定表達(dá)，所以常常用來(lái)計(jì)算組織微血管密度，從而對(duì)毛細(xì)血管新生情況進(jìn)行有效評(píng)估[2]。重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠作為一種全新的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的方法應(yīng)用于燙傷創(chuàng)面，能夠提高粒細(xì)胞的吞噬細(xì)菌能力，納米銀是一種長(zhǎng)效抗菌劑，安全性高、效力持久。本研究通過(guò)觀察納米銀抗菌凝膠聯(lián)合重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor， rhGM-CSF）對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合、巨噬細(xì)胞數(shù)量以及微血管再生的影響，為臨床換藥治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 資料和方法

1.1 主要儀器和試劑：恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司），光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠），納米銀抗菌凝膠（武漢東信醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司），rhGM-CSF凝膠劑（長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司）。兔抗CD68和CD34多克隆抗體（武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面構(gòu)建和分組：健康SD大鼠114只（6只作為非燙傷正常對(duì)照組），雌雄各半，體重190～200g，自上海邦耀生物科技有限公司采購(gòu)，采用普通飼料進(jìn)行分籠喂養(yǎng)，環(huán)境相對(duì)濕度50%～70%，溫度（25±2）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用1%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，硫化鈉對(duì)大鼠背部和腿部褪毛，溫水洗去脫毛劑，取仰臥位將大鼠脫毛處置于帶側(cè)支的圓底燒瓶口上（內(nèi)徑25mm，瓶口溫度98℃），蒸汽熏蒸10s，造成5% TBSA深Ⅱ度燙傷模型。

模型制作成功后，按照隨機(jī)數(shù)字法則分為3組，每組36只（雌雄各半），3組大鼠燙傷創(chuàng)面換藥前均采用無(wú)菌棉棒蘸取0.1%醋酸氯已定溶液進(jìn)行擦拭，然后再用生理鹽水進(jìn)行擦拭，最后用干棉棒擦干，rhGM-CSF組大鼠創(chuàng)面涂抹rhGM-CSF，聯(lián)合組應(yīng)用納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF涂抹，模型組不作任何處理。燙傷后每天換藥1次直至創(chuàng)面愈合，各組小鼠正常進(jìn)食水。正常對(duì)照組不作任何處理。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 創(chuàng)面愈合情況：采用高分辨率相機(jī)對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，保持拍攝角度和創(chuàng)面垂直，焦距相等，然后采用Photoshop像素法精確測(cè)定創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量和微血管密度：在燙傷模型建立第1、3、7、11、14、17天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組均取6只大鼠（雌雄各半）處死，無(wú)菌操作，取創(chuàng)面標(biāo)本，保留創(chuàng)緣部分正常皮膚，立即置于10%福爾馬林溶液中固定24h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫M(jìn)行巨噬細(xì)胞和微血管密度檢測(cè)。

將石蠟切片，放入40%酒精中，水浴40℃，4min，展開(kāi)，置于60℃烘箱烘片。二甲苯脫蠟，梯度酒精進(jìn)行水化，高溫高壓組織修復(fù)，加入3%雙氧水，室溫中10min，從而阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗，加入5%羊血孵育30min，除去封閉液，加入一抗（兔抗CD68進(jìn)行巨噬細(xì)胞標(biāo)記，CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞），置于4℃冰箱過(guò)夜，次日取出使用PBS沖洗，滴加生物素化山羊抗兔二抗，37℃放置20min，PBS沖洗，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃放置20min，加入DAB顯色觀察。巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)：依據(jù)DIPICTRO標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取其平均值作為創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量。微血管計(jì)數(shù)：參照Weidne標(biāo)準(zhǔn)，選擇5個(gè)血管豐富且不重復(fù)的視野觀察，在高倍鏡下計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均于SPSS 16.0軟件中統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)愈合情況比較：隨著時(shí)間的增加，三組大鼠創(chuàng)面愈合率均不斷增加。同一時(shí)間點(diǎn)，rhGM-CSF組和聯(lián)合組愈合率均高于模型組，且聯(lián)合組愈合率顯著大于rhGM-CSF組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 三組大鼠創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)組織巨噬細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)結(jié)果：三組大鼠創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量均是先增加后減小。聯(lián)合組第3、11、14天創(chuàng)面浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞數(shù)量均少于模型組和rhGM-CSF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2，圖1。

2.3 三組大鼠創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)組織微血管數(shù)量檢測(cè)結(jié)果：三組大鼠創(chuàng)傷后第3、7、11、14、17天微血管數(shù)量均高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。三組大鼠創(chuàng)面微血管數(shù)量傷后1～7d遞增，之后開(kāi)始下降，在第3、7、11天，聯(lián)合組微血管數(shù)量顯著高于模型組和rhGM-CSF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

3 討論

深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面作為燙傷領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，引起了臨床醫(yī)務(wù)工作者和科研工作者的廣泛關(guān)注。深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的愈合是一個(gè)復(fù)雜但有序的過(guò)程，需要在自身機(jī)體內(nèi)各種誘導(dǎo)和調(diào)控下進(jìn)行，需要經(jīng)歷血管反應(yīng)（止血和凝血）、細(xì)胞炎癥反應(yīng)、增殖及修復(fù)等過(guò)程[3]。

在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，巨噬細(xì)胞作為主要細(xì)胞，參與到愈合過(guò)程中的各個(gè)階段。研究表明在正常皮膚組織中，巨噬細(xì)胞均處于活化狀態(tài)，只有在外界譬如燙傷等刺激作用下才會(huì)激活。但其在燙傷愈合過(guò)程所起作用意見(jiàn)不一，有學(xué)者[4]認(rèn)為巨噬細(xì)胞的存在可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，而有學(xué)者[5]則認(rèn)為巨噬細(xì)胞會(huì)引起炎癥反應(yīng)，從而延遲創(chuàng)面愈合。有研究報(bào)道燙傷后創(chuàng)面的巨噬細(xì)胞偏向M1型，因此細(xì)胞開(kāi)始大量分泌促炎因子TNF-α， 而抗炎因子IL-10水平下降。據(jù)報(bào)道[6]，在創(chuàng)面發(fā)生感染或創(chuàng)面條件不可控時(shí)，巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)就會(huì)增強(qiáng)，從而加重燙傷程度，延遲愈合。而納米銀抗菌凝膠采用納米技術(shù)，將銀離子制成納米級(jí)顆粒，緩慢釋放，持續(xù)殺菌，避免了創(chuàng)面細(xì)菌侵入內(nèi)部發(fā)生感染，且也有報(bào)道稱(chēng)納米銀可以對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)或優(yōu)化，從而促進(jìn)抗炎因子的分泌。研究表明[7]中性粒細(xì)胞在燙傷創(chuàng)面浸潤(rùn)可以迅速清除壞死組織，rhGM-CSF能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化，增強(qiáng)其分泌功能，有利于創(chuàng)面細(xì)胞碎片和病原體的清除。本研究采用納米銀抗菌凝膠聯(lián)合rhGM-CSF對(duì)深Ⅱ度燙傷大鼠進(jìn)行治療，其愈合率顯著高于rhGM-CSF單一用藥組，這可能是納米銀抗菌凝膠抑制了細(xì)菌侵入，避免了創(chuàng)面感染，同時(shí)rhGM-CSF促進(jìn)清除病原體，兩者聯(lián)合作用，縮短了愈合周期。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)燙傷創(chuàng)面巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示其數(shù)量先增加后減少，處在動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，這可能和趨化因素以及創(chuàng)面缺乏機(jī)械屏障有關(guān)。燙傷后，聯(lián)合組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)巨噬細(xì)胞數(shù)量均比模型組和rhGM-CSF組要少，提示，聯(lián)合用藥對(duì)燙傷后創(chuàng)面巨噬細(xì)胞的數(shù)量有一定的影響，可以將創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞數(shù)量控制在一定范圍參與愈合。

研究表明[8-9]，血管生成參與到許多病理和生理過(guò)程當(dāng)中，尤其在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，需要充足大量的新生血管，為創(chuàng)面組織提供營(yíng)養(yǎng)的氧氣，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。有研究報(bào)道[10]稱(chēng)新生血管障礙或者發(fā)生延遲是創(chuàng)面延遲愈合的主要原因，如果創(chuàng)面血管數(shù)量增加，創(chuàng)面愈合時(shí)間就會(huì)縮短。本研究結(jié)果顯示在第1、3、7和11天，聯(lián)合組微血管數(shù)量均高于模型組和rhGM-CSF組，且在第3、7和11天，rhGM-CSF組微血管數(shù)量比燙傷模型組多。提示納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF能促進(jìn)血管生成，聯(lián)合用藥其促進(jìn)血管生成能力更強(qiáng)。

綜上所述，納米銀抗菌凝膠和rhGM-CSF聯(lián)合用藥治療深Ⅱ度燙傷效果確切，且納米銀抗菌凝膠可以通過(guò)影響燙傷創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量和微血管生成來(lái)影響燙傷創(chuàng)面的愈合。

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[收稿日期]2018-01-20 [修回日期]2018-02-28

編輯/朱婉蓉