云南省大理地區HPV亞型分布研究

趙立仙 畢磊 楊錫彤 王光明 何舉

[摘要] 目的 通過分析體檢人群人乳頭瘤病毒（HPV）的感染情況，以了解云南省大理地區HPV的感染特點。 方法 選取2013年1月～2015年11月大理大學第一附屬醫院體檢中心接診的女性患者2912例，根據隨機數字表法分為13型組（1587例）和21型組（1325例）。其中13型組應用熒光探針法進行13種高危型HPV檢測，21型組應用分子導流雜交技術進行21型HPV亞型檢測，并對兩種檢測技術的結果進行比較分析。 結果 13型組中，檢測出含HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危亞型的陽性患者206例，陽性率為12.98%（206/1587）；21型組中，檢測出陽性患者246例，陽性率為18.57%（246/1325）；共檢出除低危型HPV43型外的20種亞型；在20種HPV亞型感染中，HPV16型陽性率最高為29.67%（73/246），其次為HPV52亞型21.14%（52/246）。 結論 云南省大理地區HPV的感染分布具有異質性，兩種檢測方法的檢出率無差異，檢測方法的選擇應該根據臨床需要進行選擇。

[關鍵詞] 人乳頭瘤病毒；分子導流雜交；熒光探針法；宮頸癌

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0131-04

[Abstract] Objective To understand the characteristics of human papillomavirus （HPV） infection in Dali region of yunnan province by analysis of the infection of HPV in the population of physical examination. Methods From January 2013 to November 2015， 2912 female patients received in Medical Examination Center of the First Affiliated Hospital of Dali University were selected， and divided into 13 type group （1587 cases） and 21 type group （1325 cases） according to the random number table. 13 type group was used to 13 types of high risk HPV detection by real-time PCR， 21 type group was used to type 21 HPV subtype detection by molecular hybridization， and the results of two kinds of detection techniques are compared and analyzed. Results In the 13 type group， a total of 206 cases of positive patients with 13 high-risk subtypes including HPV16， 18， 31， 33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59 and 68 were detected，with a positive rate of 12.98%（206/1587）. In the 21 type group， 246 cases were infected with HPV， with the positive rate of 18.57% （246/1325）. A total of 20 subtypes except low-risk HPV43 were detected. The most common HPV genotypes were HPV16 with the positive rate of 29.67%（73/246）. Second， HPV52 subtype 21.14% （52/246） in 20 types of HPV subtypes. Conclusion The infection of HPV in Dali region， Yunnan Province， has heterogeneity. The detection rate of the two detection methods was not different， and the selection of the detection method should be selected according to the clinical needs.

[Key words] Human papillomavirus； Molecular hybridization； Real-time PCR； Cervical carcinoma

宮頸癌是成年女性第二大常見惡性腫瘤[1-2]，流行病學研究發現人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可以在幾乎所有宮頸癌的標本中找到[3]，進一步研究顯示HPV感染持續8～24個月將引起宮頸上皮內瘤變，8～12年后可發展為宮頸癌[3-4]，并且HPV多重感染的患者組織中與宮頸癌發生相關的蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin比單一感染的患者高[5]，因此針對成年女性進行HPV檢測顯得尤為重要。目前商業化的HPV檢測試劑盒主要包括HPV病毒載量檢測和HPV分型檢測。本研選取云南省大理大學第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）體檢的2912例患者，分別用13種高危型HPV檢測試劑盒與21型HPV檢測試劑盒檢測患者的HPV感染情況，從而了解大理地區HPV的感染特點以及兩種試劑盒檢測的優缺點，以便對HPV感染防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2015年11月我院體檢中心接診的女性患者2912例，根據隨機數字表法分為13型組（1587例）和21型組（1325例）。其中13型組年齡17～74歲，平均（39.90±8.37）歲，年齡分布：≤20歲4例，>20～30歲163例，>30～40歲618例，>40～50歲625例，>50～60歲145例，>60歲32例；21型組年齡17～76歲，平均（40.24±8.03）歲，年齡分布：≤20歲2例，>20～30歲119例，>30～40歲487例，>40～50歲570例，>50～60歲126例，>60歲21例，兩組患者年齡等一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究通過我院醫學倫理委員會審批，患者及患者家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 13型組 由婦科的專業人員用婦科專用陰道窺器和毛刷刷取宮頸脫落細胞，然后保存在試劑盒專用的保存液中，進行13種高危型HPV檢測。13種高危型HPV型檢測流程：參照凱普生物科技有限公司“13種高危型HPV核酸檢查試劑盒”的說明書進行操作，即宮頸脫落細胞DNA提取，然后PCR擴增（每次擴增實驗均設置陽性和陰性對照各1個），擴增體系為：PCR混合物17.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，樣品2 μL；擴增條件：95℃預變性10 min，94℃ 10 s，58℃ 50 s，45個循環，38℃ 5 s，檢查結束后從系統中調取患者的HPV檢查數據作為分析對象。

1.2.2 21型組 由婦科的專業人員用婦科專用陰道窺器和毛刷刷取宮頸脫落細胞，然后保存在試劑盒專用的保存液中，進行21型HPV檢測。HPV21型檢測流程：參照凱普生物科技有限公司“HPV核酸擴增分型檢測試劑盒”的說明書進行操作，即宮頸脫落細胞DNA提取，然后PCR擴增（每次擴增實驗均設置陽性和陰性對照各1個），擴增體系為：PCR混合物23.25 μL，DNA聚合酶0.75 μL，樣品1 μL；擴增條件：95℃預變性9 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環，72℃ 5 min。PCR擴增結束后用雜交儀進行導流雜交，雜交結束后進行酶標顯色，然后參照說明書判斷檢測樣本的基因型，在擬分析的時間段的檢查結束后，從檢測系統中提取患者HPV數據進行分析。

1.2.3 儀器和試劑 PCR儀和雜交儀（熒光定量基因擴增儀即PCR檢測系統為TL988型和擴增后進行雜交用PCR基因擴增熱循環儀，型號為DTC型）由西安天隆科技有限公司提供，熒光探針法和導流雜交的相關試劑由廣州凱普生物科技有限公司提供。13種高危型HPV檢測試劑盒檢測涵蓋包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種亞型；21型HPV檢測試劑盒檢測包括HPV16、18、31、33、35、39、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68等16種高危型別和HPV6、11、42、44，CP8304（81）等5種低危型別組成的21種亞型。

1.3 統計學方法

采用SPSS 10.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 13型組HPV感染情況

13種高危型HPV感染陽性患者206例，陽性率為12.98%（206/1587）。各個年齡段的感染情況以≤20歲的感染率最高為50.00%（2/4），其次為>20～30歲的年齡段感染率19.02%（31/163），>50～60歲的年齡段陽性率最低11.03%（16/145），不同年齡段間HPV感染陽性率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 21型組HPV感染情況

21型HPV感染陽性患者246例，陽性率為18.57%（246/1325）。如果排除13種高危型HPV檢測試劑盒不能夠檢測的HPV43、53、66、6、11、42、44，CP8304（81）的8種亞型外，陽性率為16.30%（216/1325）。各個年齡段的感染情況以>20～30歲的感染率最高，為38.66%（46/119），其次為>30～40歲的年齡段感染率19.51%（95/487），>50～60歲的年齡段陽性率最低10.32%（13/126），不同年齡段間HPV感染陽性率比較，差異無統計學意義（P > 0.05），見表1。與13種高危型HPV檢出效率比較，差異無統計學意義（P=0.187）。

2.3 高危亞型和低危亞型感染情況

21型HPV感染陽性的246患者中，高危亞型感染229例，占陽性患者的93.09%（229/246）；低危亞型感染30例，占陽性患者的12.20%（30/246）；高危、低危亞型混合感染13例，占陽性患者的5.28%（13/246）。在21型HPV感染陽性患者中，單一感染201例，占81.71%（201/246）；2種亞型感染37例，占15.04%（37/246）；3種亞型以上感染8例，占3.25%（8/246），其中單個患者最多混合感染亞型為4種亞型，僅僅1例。

2.4 HPV亞型感染分布

在21種HPV感染的246例陽性患者中，HPV16亞型是高危亞型感染最高的型別，陽性率為29.67%（73/246），其次HPV52亞型為21.14%（52/246）；低危亞型感染中以HPV81亞型最高，為6.10%（15/246），各種亞型的感染情況。見表2。

3 討論

宮頸癌主要由高危亞型HPV持續感染后，宮頸上皮發生病理改變而形成[6-9]。大量的臨床和基礎研究及其循證醫學的Meta分析均發現，HPV感染，尤其是高危型感染與宮頸癌的發生密切相關。因此要達到宮頸癌的早期發現和診治，HPV檢測就顯得尤為重要[10]。由于宮頸癌的發生、發展與遺傳異質性密切相關[7，11]，而云南省大理地區HPV感染相關的數據報道較少，因此對大理地區居民的HPV感染情況進行研究。

HPV檢測包括HPV載量檢測和HPV分型檢測。在本研究中，利用13種高危型HPV檢測試劑盒檢測了1587例患者病毒載量，陽性率為12.98%（206/1587）；而利用21型HPV檢測試劑盒檢測了1325例患者的感染亞型，陽性率為18.57%（246/1325），如果排除13種高危型HPV檢測試劑盒不能夠檢測的HPV43、53、66、6、11、42、44，CP8304（81）八種亞型外，陽性率為16.30%（216/1325），兩種檢測方法在檢出效率方面無差異（P > 0.05）。

國內相關文獻報道，子宮頸癌的發病高峰為>35～39歲和>60～64歲[12-13]，而本研究結果提示：13種高危型HPV檢測的結果為≤20歲的感染率最高為50%（2/4），其次為>20～30歲年齡段的感染率19.02%（31/163），而21種HPV感染檢測中以>20～30歲的感染率最高38.66%（46/119），其次為>30～40歲年齡段的感染率19.51%（95/487），兩種檢測技術均顯示>20～30歲為高發年齡，與我國其他地區HPV感染的高發年齡相比，年齡偏低[14-16]。由于≤20歲年齡的患者較少，因此其感染率不能夠代表該地區該年齡段的感染情況。大理地區HPV感染的高發年齡與中國HPV感染的高峰年齡不完全一致，可能與該地區的地域差異有關。

利用21型HPV試劑盒對大理地區的人群的研究發現，高危亞型感染最多的是HPV16亞型，陽性率為29.67%（73/246），其次為HPV52亞型為21.14%（52/246）；低危亞型感染中，感染率最高的是HPV81亞型為6.10%（15/246），而中國人群最常見的HPV基因型為HPV16、53和CP8304，大理地區的HPV感染型別表現出一定的地域特點，該感染特點也與國內的其他地區、以及與東南亞、南非等地的感染優勢亞型不完全相同[4，5，12，13，15]。因此本研究說明HPV感染率的高低、以及不同地區HPV感染的型別具有一定的異質性，其原因可能是病毒因素、宿主因素和環境因素交互作用的結果[2，17-18]。因此在臨床治療以及疫苗研發和應用上，針對臨床目的的不同，以選擇不同的取材方式、檢測方式及其亞型的分布[19-20]。

綜上所述，云南省大理地區13種高危亞型HPV的感染率、21種HPV的感染率以及兩種檢測方法所得到的各個年齡段的感染率均與其他地方基本相同；但是在21種HPV檢測得到的結果提示具有一定的特異性，因此在HPV檢測中兩種方法的選擇應該以臨床的需要進行選擇，抗病毒治療，那么需要得到病毒載量的改變情況，選擇13種高危型HPV檢測，如果需要進行HPV疫苗治療，那么應該選擇21種HPV檢測。

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