miR-29b通過抑制N2a細胞p53凋亡通路減輕氧糖剝奪/再灌注損傷

陳 立， 鄒偉婕， 張 宇， 張 帥， 王黎洲， 周 石

缺血性腦卒中約占所有腦卒中患者87%［1-2］，現階段雖進行大量臨床試驗研究，但除了早期靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑（rt-PA）和介入治療外，再無其它更有效的臨床治療手段［3-4］。腦卒中觸發一系列復雜細胞分子間反應，最終導致神經細胞在腦缺血中發生壞死、凋亡、氧化應激和炎性反應等［5-7］，但腦卒中誘導的細胞死亡和神經功能障礙確切機制目前仍不清楚。既往研究表明腫瘤抑制蛋白p53是一種能介導大量細胞內外反應，并在細胞周期阻滯和凋亡中起關鍵作用的轉錄因子［8］。葡萄糖剝奪（glucose deprivation，GD）結合氧糖剝奪（oxygenglucose deprivation，OGD）是腦缺血常見體外模型［9-11］。闡明 OGD/再灌注（reperfusion，R）所誘導神經元死亡的潛在細胞和分子機制，無疑有助于腦缺血神經保護藥物開發。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是由19～22個核苷酸（NT）組成的非編碼RNA，作為轉錄后重要調節因子，常與多靶點信使RNA（mRNA）協同調控靶基因［12］。 越來越多研究發現miR在各種生物學過程，如心血管相關疾病中細胞增殖、分化、凋亡和信號轉導中具有重要作用［13-15］。有研究證實miR在腦缺血反應中起重要作用［16］，在前腦缺血［17］、局灶性腦缺血［18］及缺血性腦卒中患者中與缺血性腦損傷密切相關［19］，并進一步證實miR-29家族在缺血性腦損傷中發揮重要作用。目前關于miR-29功能的爭議在于其到底是對抗還是促進神經細胞凋亡［20］。許多研究顯示miR-29在不同細胞或不同病理/生理條件下與不同靶點結合，抗凋亡和促凋亡作用均會產生［21-23］。一項研究表明腦梗死部位miR-29b缺失是腦卒中關鍵因素之一，miR-29b類似物治療降低腦卒中引起的神經細胞死亡和腦梗死面積［24］。本研究旨在通過神經細胞損傷和卒中結局背景下細胞生物學和體外實驗，探討miR-29b在腦缺血進展中經p53介導凋亡通路對腦缺血性損傷是否有治療作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及試劑

miR-29b激動劑和抑制劑序列（上海吉瑪制藥技術公司）、p53小干擾RNA（siRNA）序列和陰性對照siRNA（美國Thermo Fisher科技公司）、溴化噻唑藍四氮唑（MTT）法檢測試劑盒和Hoechst 33258染色液（美國Sigma-Aldrich公司）、乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-3活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司）、兔抗-Bax抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體及山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）共軛二次抗體（美國CST公司）。本實驗所有試劑均為分析純級。

1.2 N2a細胞培養

取小鼠成神經細胞瘤N2a細胞（美國菌種保藏中心，ATCC），置于加入 10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良伊格爾培養基（DMEM），37℃、5%CO2、95%O2環境下培養。培養介質1～2 d更換1次。

1.3 OGD/R模型建立及miR-29b激動劑等轉染

對N2a細胞作OGD處理，置于脫氧葡萄糖DMEM， 在 5%CO2、1%O2、94%N2缺氧環境下培養4 h，然后置于含葡萄糖DMEM，正常培養條件（5%CO2、95%O2）下于 0、3、6、12、24 h 作 R 處理，體外腦缺血狀態模型建立。采用實驗濃度Lipofectamine 3000轉染試劑（美國Invitrogen公司）對miR-29b激動劑、抑制劑、陰性對照miR、p53 siRNA和陰性對照siRNA進行轉染，6 h后按指示時間用OGD/R處理N2a細胞，了解OGD/R模型中N2a細胞miR-29b和p53所起作用。將N2a細胞隨機分為6組：空白對照組（C組）、OGD/R組、OGD/R+轉染 miR-29b激動劑組（OGD/R+miR-29b M組）、OGD/R+轉染miR-29b抑制劑組（OGD/R+miR-29b I組）、轉染 miR-29b激動劑陰性對照組（miR-29b M組）、轉染miR-29b抑制劑陰性對照組（miR-29b I組）。實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測N2a細胞中miRNA轉染效率（基于miR-29b水平），免疫印跡法檢測p53 siRNA轉染效率（基于p53水平）。hsa-miR-29b激動 劑 有 義 鏈 為 ：5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’， 反義鏈為：5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’； 陰性對照miRNA有義鏈為：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’， 反義鏈為：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4 MTT比色法和LDH檢測

N2a細胞接種至96孔5×104細胞/mL培養板，加入 5 mg/mL MTT 液（20 μl/孔）并在 37℃下培育 3～4 h，加入 150 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解深藍色晶體；微孔板檢測器（Thermo MK3酶標儀）于490 nm吸光度處檢測細胞存活。對照組不作任何處理，表示為100%細胞存活值，其余各組按此值作歸一化處理。96孔板中培養N2a細胞，隨后同上述處理；微孔板檢測器于490 nm吸光度（D490）處測定培養上清液中LDH水平。對照組不作任何處理，表示為100%值，其它組歸為此值。

1.5 Hoechst 33258染色觀察N2a細胞凋亡形態特征

N2a細胞接種至24孔培養板并進行處理，用冷磷酸緩沖液（PBS）輕輕沖洗N2a細胞2次，4%多聚甲醛固定15 min；PBS沖洗3次，Hoechst 33258染色液（5 μg/mL）染色 10 min；PBS 洗滌 3 次，OlympusⅨ71熒光顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察細胞核表現出明亮熒光，細胞呈收縮或固縮形態及典型核凝聚現象視為凋亡細胞，彌漫性熒光細胞歸為存活或有活性。

1.6 caspase-3活性檢測

按上述方法處理N2a細胞，6孔培養板上接種N2a細胞，處理后4℃、12 000轉速離心10 min，收集離心后蛋白提取物，生物蛋白試劑盒（美國Bio-Rad Laboratories公司）測定蛋白濃度；96微孔培養板中加入30 μg等量蛋白提取物，37℃下與caspase-3活性顯色底物（Ac-DEVD-pNA，100 μm）培養 4 h；微孔板檢測器于D405處檢測caspase-3活性。采用非誘導細胞完成檢測，也先用Ac-DEVD-CHO進行比較分析。

1.7 RNA分離和RT-qPCR分析

Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取培養的N2a細胞總RNA，用含miRNA特異性引物的TaqMan miR定量PCR試劑盒（美國Thermo Fisher科技公司）從1 μg總RNA中合成第一鏈cDNA；PCR反應后，按使用說明書程序，用ABI Prism 7900HT型熒光 qPCR儀（美國 ABI公司）、All-in-OneTMqPCR Mix試劑（美國GeneCopoeia公司）檢測miR-29b水平。qRT-PCR 檢測過程：94℃變性 5 min，94℃解鏈 60 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，40 個周期 72℃延伸10 min；RNU6視作內部控制基因；miR擴增引物：miR-29b前引物為 5’-GGGTAGCACCATTTGAAATC-3’，miR-29b 后引物為 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’，U6 前 引 物 為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6 后引物為 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。所有實驗重復3次，所有樣品均為正常內部控制。采用比較CT分析（2-△CT）獲得數據lg2（基因芯片歸一化信號）。

1.8 免疫印跡分析

低溫下用放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解緩沖液（海門生物技術公司）提取蛋白30 min后，用二辛可酸（BCA）試劑盒檢測蛋白濃度；12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，美國Sigma-Aldrich公司）法分離等量蛋白樣品（30～50 μg蛋白/泳道）并轉移至硝酸纖維素（NC）濾膜（美國Pall Corporation公司），室溫下用5%脫脂奶粉阻斷2 h后，NC膜同主要抗體（Bax以1∶1 000稀釋，Bcl-2以1∶500稀釋）培育一夜；含0.1%吐溫Tris緩沖0.9%NaCl溶液（TBST）清洗 3次，HRP標記的羊抗兔（3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH，1∶5 000稀釋）培育1 h；化學發光試劑（美國Pierce生物技術公司）檢測標記的蛋白條帶，用Quantity One灰度分析軟件（美國Bio-Rad Laboratories公司）進行圖像分析。免疫印跡分析反復進行3次。

1.9 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件包對所有統計數據進行比較和分析。所有3個獨立實驗數值均表示為均數±標準差（x±s），各組間差異先用單因素方差分析檢驗，后用最小顯著性差異檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OGD/R處理后miR-29b水平變化

N2a細胞經OGD 4 h，RT-qPCR檢測不同R處理時間點（0、3、6、12、24、48 h）N2a 細胞中 miR-29b表達，結果顯示miR-29b水平與空白對照組相比明顯下調，R處理12 h達平臺期（圖1①），N2a細胞活力經 OGD（4 h）和 R（12 h）處理顯著降低（圖 1②），LDH釋放增加（圖1③）；表明OGD/R處理可誘導N2a細胞毒性，miR-29b水平隨之降低，這可能與腦缺血性損傷有關。

圖1 OGD/R處理對N2a細胞miR-29b水平的影響

2.2 miR-29b對OGD/R處理N2a細胞的影響

經 ODG（4 h）/R（12 h）處理，miR-29b 激動劑轉染明顯提高了miR-29b水平，miR-29b抑制劑轉染明顯降低了miR-29b水平，陰性對照組分別對miR-29b水平無影響（圖2①）；表明miR-29b激動劑或抑制劑可成功地提高或降低N2a細胞miR-29b水平。MTT法和LDH法分別檢測miR-29b激動劑和抑制劑對經OGD/R誘導N2a細胞活性和凋亡的影響，結果顯示陰性對照組miR-29b激動劑或抑制劑對細胞活性和LDH漏出率無影響；ODG（4 h）/R（12 h）處理后N2a細胞活力明顯減低，這種作用在miR-29b激動劑作用下會逆轉，在miR-29b抑制劑作用下會加重（圖2②）；miR-29b激動劑降低LDH漏出率，miR-29b抑制劑增加LDH漏出率（圖2③）。結果表明，OGD/R誘導的N2a細胞損傷經由抑制miR-29b水平實現。

圖2 OGD/R處理后N2a細胞中miR-29b激動劑和抑制劑對細胞存活及LDH漏出率的影響

2.3 miR-29b對N2a細胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色顯示，miR-29b激動劑或抑制劑單獨應用對N2a細胞凋亡無影響；OGD/R處理增加了N2a細胞中核碎裂現象及作為凋亡細胞代表性的亮藍色核數量，這些反應會被miR-29b激動劑消除，miR-29b抑制劑放大（圖3①）；miR-29b激動劑轉染減弱OGD/R處理后細胞凋亡過程中最主要執行者caspase-3活性，miR-29b抑制劑加強OGD/R處理后caspase-3活性（圖3②）；結果表明miR-29b有抑制OGD/R誘導的N2a細胞凋亡的作用。

2.4 miR-29b對N2a細胞凋亡相關信號轉導的影響

免疫印跡法檢測Bax與Bcl-2表達見圖4①，miR-29b激動劑和抑制劑單獨轉染對N2a細胞凋亡相關蛋白無影響，OGD/R處理顯著增加了Bax蛋白表達并降低Bcl-2蛋白表達，miR-29b激動劑對N2a細胞預刺激能阻斷這些反應，也可通過miR-29b抑制劑對N2a細胞預刺激加重這些反應（圖4②③），miR-29b激動劑下調 p53蛋白水平，miR-29b抑制劑上調p53蛋白水平（圖4④）；表明miR-29b激動劑和抑制劑會改變p53介導凋亡信號轉導通路，miR-29b對抗OGD/R誘導N2a細胞損傷的作用可能在于p53信號轉導通路激活與Bax和Bcl-2蛋白表達的交替變化。

圖3 miR-29b激動劑和抑制劑對OGD/R誘導N2a細胞凋亡的影響

2.5 野生型p53特異性質粒DNA對p53過表達的影響

圖4 miR-29b激動劑和抑制劑對N2a細胞凋亡相關蛋白的影響

N2a細胞經野生型p53（wt-p53）siRNA轉染后用miR-29b激動劑處和OGD/R處理，免疫印跡法檢測顯示wt-p53基因可明顯增加N2a細胞p53蛋白水平（圖5①），MTT法檢測顯示OGD/R處理后經wt-p53轉染，miR-29b激動劑誘導N2a細胞存活率增加明顯減弱（圖5②），miR-29b激動劑減少LDH漏出率也被N2a細胞轉染的wt-p53基因阻斷（圖5③）；表明p53基因過度表達能逆轉miR-29b對抗OGD/R誘導的N2a細胞損傷，p53介導miR-29b調控OGD/R誘導的N2a細胞損傷。

3 討論

腦缺血性損傷由細胞興奮性毒性、線粒體功能障礙、氧化應激和炎性反應等不同途徑介導，具有復雜的相互作用機制，目前臨床上用于腦缺血治療的藥物和治療靶點的生物標志物均不夠理想。本研究發現OGD/R誘導的N2a細胞缺血模型在R期間miR-29b水平下調，最重要的是通過負調控p53相關細胞凋亡，miR-29b可誘導神經細胞保護作用，發揮抗細胞凋亡作用。

圖5 wt-p53基因編碼質粒DNA對細胞活性和LDH漏出率的影響

很多實驗證實，miR在腦缺血損傷反應中起著重要作用［12，25］。近期研究也確定miR在腦細胞缺血損傷中的作用，miR-29家族在評估損傷和確定腦卒中預后中扮演重要介質作用［26］。Khanna 等［24］研究發現miR-29b水平在大腦中動脈閉塞所致缺血性卒中梗死組織中明顯降低。本研究數據也提示OGD/R處理后N2a細胞中miR-29b水平顯著降低。miR-29研究目前主要集中在其對細胞凋亡信號通路的調控作用，miR-29b是促凋亡還是抗凋亡尚存爭議［20］。腦缺血損傷中，局灶性腦缺血通過提高Bcl2L2（BCL-w蛋白，一種抗凋亡的Bcl-2蛋白家族成員）水平［27］造成miR-29水平下調，促進神經細胞凋亡；但在神經細胞成熟過程［22］中就前腦和局灶性腦缺血［21，24］而言，miR-29 水平上調可發揮抗凋亡作用，保護神經細胞。因此，腦缺血損傷中miR-29b表達及功能有待確定。本研究發現在N2a細胞中，通過miR-29b激動劑造成miR-29b水平有效上調，能明顯增加神經細胞活力并減少LDH漏出率，說明miR-29上調可保護神經細胞，對抗OGD/R誘導的細胞毒性。眾所周知，由Bcl-2（抗凋亡蛋白）、Bax（促凋亡蛋白）等組成的Bcl-2蛋白家族是一種通過調節線粒體膜完整性、功能和凋亡信號，針對細胞凋亡的主要調節因子。有研究報道Bcl-2蛋白成員過度表達能對體內和體外腦缺血損傷模型產生神經保護作用［28］。本研究還發現OGD/R處理后能顯著降低caspase-3活性和Bcl-2表達，增加Bax蛋白表達，但miR-29b激動劑可阻斷這些細胞水平調節和變化，miR-29b抑制劑則加劇上述反應；miR-29b可通過調節Bcl-2家族發揮對腦缺血損傷的保護作用。

p53蛋白是細胞周期阻滯、細胞凋亡、DNA修復和遺傳穩定性等一系列細胞應激反應的主要協調者。一些研究表明p53參與了腦卒中和神經退行性疾病造成的神經元細胞死亡［29-30］。有研究顯示，從急性腦損傷如腦缺血、癲癇及慢性神經變性疾病患者提取的腦組織樣本中，p53表達顯著升高。本研究顯示N2a細胞經OGD/R處理后，p53表達顯著增加，與上述報道結果一致。一些研究揭示了一種由p53介導獨立轉錄時促凋亡的新機制［31］，p53通過與Bcl-2家族多結構域成員相互作用直接參與內源性凋亡途徑，維持線粒體功能［32］。研究表明，某些神經元損傷可經p53、Bax、細胞色素c釋放，線粒體功能障礙和caspase激活等常見信號轉導通路發生；線粒體釋放促凋亡蛋白前，p53信號轉導便可引起缺血神經細胞凋亡［33］，而導致p53信號轉導和神經元死亡的上游事件尚不清楚。本研究發現，OGD/R條件下p53水平上調伴隨Bax水平上調和Bcl-2水平下調，wt-p53質粒DNA轉染可提高p53水平，與miR-29b激動劑和OGD/R聯合處理組相比，明顯降低N2a細胞活力并增加LDH漏出率。可見，經OGD/R誘導的N2a細胞損傷中miR-29b對p53介導的細胞凋亡有保護作用。

總之，miR-29b水平在OGD/R模擬的腦缺血損傷模型中下調。miR-29b激動劑可減輕OGD/R誘導的細胞毒性和細胞凋亡，miR-29b抑制劑則加重OGD/R誘導的細胞毒性和細胞凋亡，表明miR-29b在N2a細胞OGD/R損傷起保護作用。此外，經OGD/R處理增加p53蛋白表達，可阻斷miR-29b對OGD/R損傷的有益作用，故p53在miR-29b抑制OGD/R誘導N2a細胞凋亡中發揮了中介介導作用。miR-29b可調控p53途徑介導的體外腦缺血性損傷模型神經細胞凋亡，將來可能為缺血性腦卒中提供一潛在治療靶點。

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