小鼠Willis環右頸總動脈灌注Microfil成像研究

陳 驀， 王 武，李永東， 李明華

Willis環由兩側大腦前動脈起始段、兩側頸內動脈末端、兩側大腦后動脈借前、后交通動脈連通而成，其作用是調節血液分配，維持腦營養和功能活動。Willis環是顱內動脈瘤和腦缺血好發部位，顱內動脈瘤尤其好發于Willis環動脈分叉部［1］。小鼠因體型小、便于操作、價格便宜、轉基因種系多等優勢常用于腦動脈瘤、腦缺血、阿爾茲海默癥等［2-5］模型的Willis環建模。通過小鼠Willis環灌注成像了解其完整結構，可為小鼠腦動脈瘤和腦缺血模型提供有效的實驗證據。目前Willis環灌注方法多通過小鼠心尖處（左心室）進行心臟灌注，應用不同灌注劑（混合或不混合染液），最后取腦觀察Willis環。這些方法雖可觀察到Willis環結構，但多不完整或充盈不良，對微小腦動脈瘤就更難以清晰顯示。為解決這些問題，本實驗通過小鼠右側頸總動脈灌注對比劑Microfil顯示Willis環，旨在評價其成像可行性和效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級C57BL/6小鼠20只（雄性，約14周齡，重約20 g）。本實驗設施環境條件符合中國國家標準《實驗動物環境及設施》（GB14925-2001）對屏障動物實驗設施的有關標準，動物飼養管理和動物實驗操作符合《上海市實驗動物管理條例》等法規要求。所有小鼠經標準實驗室飲食喂養。研究時間為2016年3月至2017年6月。

1.2 方法

小鼠肌內注射肝素（500 U/kg），30 min后肌內注射氯氨酮稀釋液（1∶4）0.2 mL作麻醉；固定小鼠后解剖胸腔，依次自心尖灌注37℃0.9%氯化鈉溶液10 mL、4%多聚甲醛溶液和2%戊二醛溶液混合液（1∶1）15 mL；顯微鏡下分離右側頸總動脈，將24 g留置針從心尖插入右側頸總動脈起始部或中段，連接注射器后30 min內勻速緩慢推注Microfil（MV-130∶稀釋劑 ∶硬化劑＝4∶5∶0.45）5 mL， 灌注操作示意圖見圖1；灌注后小鼠4℃過夜，從面部分離顱底骨后取腦，浸入4%甲醛中2～3 d，Stemi 508型和Axiocam 506 color型體視鏡（德國Carl Zeiss公司）下觀察。

1.3 評價

圖1 小鼠灌注操作示意圖

將體視鏡下觀察到的Willis環定義為3種狀況：①完全充盈，即所有血管包括雙側頸內動脈、大腦中動脈和大腦前動脈充盈良好、灌注清晰，立體感強；②大部分充盈，即部分血管充盈良好、灌注清晰；③充盈不良，即僅有少部分血管充盈良好。

2 結果

通過小鼠右側頸總動脈途徑Microfil灌注Willis環成像技術建立的小鼠Willis環形態結構見圖2。20只實驗小鼠全部灌注成功，總灌注成功率為100%。其中完全充盈11只（55%），大部分充盈4只（20%），充盈不良5只（25%）。大體觀察小鼠灌注后Willis環完整，染色血管顯示清晰；體視鏡下觀察小鼠Willis環清晰、充盈、立體。

3 討論

圖2 小鼠Willis環形態結構

相比大型動物，小型動物（如鼠科、兔等）更常用于動脈瘤和腦缺血建模試驗［6］。其中鼠科動物體型小、價格便宜，且因轉基因技術發展有著廣泛種系，可進行復雜分子和細胞技術檢測［7］，故最常用于動脈瘤和腦缺血實驗研究，而小鼠Willis環灌注常作為實驗環節一部分。

小鼠Willis環灌注前試驗已有學者報道，但方法與本研究有所不同。Lee等［8］對小鼠皮下注射肝素再麻醉30 min后，先灌注溫0.9%氯化鈉溶液和2%戊二醛，再以持續100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）壓力向左心室灌注多聚甲醛固定血管，腦充盈后在55℃恒溫箱過夜聚合，再浸入15%氫氧化鉀溶液腐蝕，流水沖洗，浸入5%蟻酸15 min，冷凍干燥機中脫水48 h；脫水樣本覆蓋上離子涂層后于掃描電鏡（韓國COXEM公司）下觀察。此方法可觀察到清晰的動脈圖像，但灌注方法操作復雜，處理時間長，腐蝕劑存在一定危險性，且未經染色，觀察效果欠佳。李廣意等［9］在實驗小鼠麻醉后，體視顯微鏡下向左心室灌注填充劑（過氯乙稀10 g、乙酸乙脂90 mL、鄰苯二甲丁2.7 mL和紅色油料適量按比例配制），再將小鼠頭部分離并浸于鹽酸，對顱骨進行腐蝕軟化；待顱骨軟化后用手術器械剝離，于體視鏡下觀察。此方法優點是所取Willis環完整，缺點是取腦操作復雜，需要鹽酸反復腐蝕小鼠顱骨，還要再用器械修飾。Sugiyama等［10］在小鼠麻醉后左心室插管，先后注射0.9%氯化鈉溶液2 mL和預先混有Mogul L碳黑50 μL的乳膠復合物0.5 mL進行灌注。

通過左心室進行心臟灌注，Willis環不易完全充盈。為解決這一問題，本實驗在保留前實驗優點基礎上對某些步驟加以改進。首先，與之前學者研究的通過心尖-左心室-主動脈弓-頭臂干-右側頸總動脈-右側頸內動脈-Willis環行心臟灌注途徑不同，本實驗經右側頸總動脈-右側頸內動脈-Willis環途徑灌注，省去了心尖-左心室-主動脈弓-頭臂干這一中間環節，使得灌注血管充盈度更好，Willis環動脈顯像更加具有立體感。相比于其它研究者灌注后易于觀察Willis環血管外徑，本實驗灌注后更易于觀察Willis環血管內徑，達到MRA觀察效果。其次，本實驗選擇Microfil對比劑進行小鼠Willis環灌注。Microfil是由MV染劑、稀釋劑、硬化劑按一定比例混合而成的復合物。在生理注射壓力下灌注Microfil即能充滿小鼠微血管，并使其不透明；Microfil具有微小收縮性，可完全填充血管，提高血管灌注連續性，保證灌注后微循環在觀察時清晰生動；經Microfil灌注的組織顏色具有多樣化，便于顯微檢查和攝片［11］。再次，小鼠經灌注后從面部分離顱底骨取腦，無需腐蝕取腦。經過改進后，操作步驟得以簡化且更安全，試驗用時相應縮短。

實施本實驗需注意：①Microfil濃度配比。硬化劑濃度過高可能在未完全灌注前Microfil先凝固，不能完成灌注，濃度過低則長時間灌注也不凝固，導致血管充盈不充分。②0.9%氯化鈉溶液和固定劑推速可相對較快。Microfil灌注速度應緩慢勻速，流量過快可能造成小血管破裂，Willis環得不到完全灌注。但應注意Microfil要在30 min內灌注完成。

本實驗結論認為，通過小鼠右側頸總動脈途徑灌注Microfil顯示Willis環方法簡單、可行，不僅能使小鼠Willis環充盈良好，還能清晰顯示其立體結構，具有MRA成像效果。

［參 考 文 獻］

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［9］ 李廣意，鄒柯杰，趙 娟，等.利用灌注技術觀察昆明小鼠Willis環的形態結構［J］.實驗動物科學，2014，31：21-22.

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［11］ Zhu YQ， Dai DY， Xing HX， et al.Concomitant aneurysm detection in an intracranial dolichoectasia mouse model using a MicroFil polymer perfusion technique［J］.J Neurointerv Surg，2017，9：783-786.