MTT法比較天龍發酵前后抗肺腺癌A549細胞效果

劉 穎，王彥多，曹廣超，施東方，呂迎蘭，王集會，史 磊*

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學 實驗中心，山東 濟南 250355)

天龍Gekko(L.)學名壁虎，又稱守宮、檐龍。其作為我國傳統的中藥材，性寒味咸，具有祛風止痛、通絡散結、解毒定驚等作用[1]，歷史悠久。現今更有研究表明中藥天龍在抗腫瘤、促進再生和調節免疫力等方面具有藥用價值[2]，特別是在對抗惡性腫瘤、結核病、骨髓炎等疑難雜癥具有藥用價值和發展前景[3]。

本實驗采用白僵菌對中藥天龍粉發酵，然后對比發酵前后天龍水提物與醇提物對肺腺癌A549細胞的抑制效果，為今后對中藥天龍的深入研究奠定基礎。

1 實驗耗材

1.1 試劑

蒸餾水；無水乙醇(鄭州卓利化工產品有限公司)；改良型RP-MI-1640培養基、胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；胰酶(上海碧云天生物技術有限公司)；MTT、DMSO(武漢市蓋云天生物技術有限公司)；注射用順鉑(20mg/支，批號：30200896， 齊魯制藥有限公司)。

1.2 儀器

FA1004N十萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；disb-zc型低溫冷卻循環水真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(默飛世爾科技(中國)有限公司)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；EL340i型全自動酶標儀(Molecular Davices)；Memmert CO2培養箱(北京五洲東方科技發展有限公司)；100型Nikon 倒置顯微鏡(Japan)。

1.3 藥品

天龍粉(批號：20150801)；發酵天龍粉(批號：20151001)。

1.4 細胞

肺腺癌A549細胞株(由山東省立醫院提供)。

2 實驗方法

2.1發酵天龍粉的制備

參照文獻[4]中 2.1項下制備發酵天龍粉。

2.2 水提物的制備

取發酵前后天龍粉各0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL蒸餾水加塞超聲提取20min，抽濾，取濾渣再次置于錐形瓶中，重復上述操作共3次并將3次濾液合并。按照3000 r/min離心10min，然后置于冷凍干燥機中制備凍干粉。

2.3 醇提物的制備[5]

取發酵前后天龍粉各0.5 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 80%乙醇，80℃水浴回流加熱75min，抽濾，取濾渣再次置于圓底燒瓶中，重復上述操作并將兩次濾液合并。將濾液置于蒸發皿中，40℃水浴鍋加熱下蒸干溶劑得到浸膏。

2.4 MTT法體外實驗

2.4.1 配制不同濃度藥物

取2.2項和2.3下的提取物0.0100 g，加入5 mL 1640培養基，配制成藥物濃度為2 mg/mL的稀釋液。在生物安全柜中用0.22 μm的濾膜過濾2次，然后用無菌1640培養基將稀釋液再次依次稀釋為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的濃度。

2.4.2 抑瘤實驗

將形態良好、處于對數生長期的肺腺癌A549細胞接種于96孔細胞培養板，去除邊緣效應并預留3個調零孔，每孔100 uL，放置在培養箱中37℃、5% CO2濃度培養24 h。24 h后取出細胞板，輕拍細胞板背面使原有培養液流出，加入2.4.1項下藥物，每個藥物濃度重復5個孔，每孔100 μL；再向另外5個孔中加入無血清的1640培養基作為空白組，每孔100 μL；向剩下5個孔中加入濃度為100 mg/mL的順鉑作為對照組，每孔100 mL，放入培養箱中相同條件培養24 h。24 h后取出細胞板避光加入MTT，每孔20 μL，放入培養箱繼續培養4 h。4 h后取出，將藥物和MTT一并吸出，加入DMSO，每孔100 μL。將細胞板放入酶標儀中于490nm波長處測定OD值，按下式計算抑制率。

3 結果與分析

3.1 天龍水提物

圖1 發酵前后天龍水提物對肺腺癌A549細胞的抑制效果

從圖1中可以看出發酵前天龍粉水提物對肺腺癌A549細胞沒有抑制作用，而發酵后的天龍粉水提物在藥物濃度為2 mg/mL時對肺腺癌A549細胞的抑制率可高達96.69%。本組實驗中陽性對照順鉑組的抑制率為61.49%，可見發酵后天龍粉水提物對肺腺癌A549細胞的抑制效果相比于臨床常用藥順鉑更具有優勢。

3.2 天龍醇提物

圖2 發酵前后天龍醇提物對肺腺癌A549細胞的抑制效果

從圖2中可以看出發酵前天龍粉醇提物對肺腺癌A549細胞并沒有抑制作用，反而相當于營養物質有助于細胞增殖。而發酵后天龍粉的醇提物對乳腺癌A549細胞具有良好的抑制效果。在藥物濃度為0.5 mg/mL時即可達到抑制率90%以上，藥物濃度為2 mg/mL時抑制率達到最高為99.14%。本組實驗中陽性對照順鉑組的抑制率為59.38%，可見發酵后天龍粉醇提物對肺腺癌A549的抑制效果相比于順鉑也更具優勢。

4 討論與結論

發酵是中藥研究領域的一種常用手段，大多應用于植物類中藥，而本實驗將蟲類中藥天龍進行生物發酵，具有一定的創新性和研究意義。而且生物發酵也是中藥炮制與加工的一種方法，許多發酵后的中藥在臨床研究中也取得良好成果[6]。

白僵菌是一種藥物真菌，它在發酵過程中通過生物轉化會生成許多或水溶或脂溶性的具有藥理活性的物質，例如多肽、多糖、黃酮、萜類化合物等。這些次生代謝產物除了對人體多個系統具有防病治病的功能外，還具有抗癌抗炎、抗氧化等作用[7]，因此本實驗采用白僵菌發酵中藥天龍也是以得到這些次生代謝產物為目的。

本實驗中采用超聲水提法可得到天龍粉中水溶性活性物質，如水溶性蛋白、多糖、核酸、維生素等。王穎[8]等人在前期研究中已發現中藥天龍發酵后水溶性蛋白與多糖的含量增多，尤其是蛋白質含量可達發酵前的兩倍。可大致推測發酵后天龍水提物具有抗癌效果可能與蛋白質含量劇增有關，但實際情況還需要繼續分離純化來驗證，目前提供了研究方向。使用80%乙醇對天龍粉進行回流提取時可使大量的黃酮類物質溶出，避免了極性過小的脂溶性大分子物質和極性過大的水溶性物質溶出對醇提物的純度進行干擾，但仍然難以避免部分水溶物質[5]，其水溶部分可今后繼續研究。

本次實驗證明了白僵菌發酵后的天龍不論水提物還是醇提物對肺腺癌A549細胞都具有良好的抑制效果，相比之下醇提物更具優勢，這為今后中藥天龍對抗肺腺癌549細胞株的研究指明了方向。

參考文獻

[1]王 穎,蔡梅超,王立娜,等.天龍粉酶解工藝中最佳用酶的研究[J].中南藥學,2017,15(9):1221-1224.

[2]劉妍婕,吳小東,徐寒梅.壁虎藥用價值的研究進展[J].藥學進展,2015,39(12):915-919.

[3]葉云珍.中藥壁虎的研究進展[J].中藥材,2009,32(7):1160-1163.

[4]劉 穎,劉春雨,曹廣超,等.美洲大蠊粉發酵前后水溶性活性物質含量對比研究[J].化工時刊,2017(3):1-3,6.

[5]王彥多,劉春雨,呂世潔,等.正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝[J].食品工業科技,2017,38(7):183-186,192.

[6]李 津,宋 強.藥用真菌發酵中藥及復方的可行性分析[J].遼寧中醫雜志,2014,41(1):48-49.

[7]李 羿,楊 勝,萬德光. 藥用真菌液體發酵研究進展及存在問題探討[J].中草藥,2012(10):2066-2070.

[8]王 穎,馬明珠,王立娜,等.發酵前后天龍粉水溶性活性物質含量對比研究[J].湖南中醫雜志,2016,32(9):166-168.