天龍混合酶最佳酶解工藝研究

王 靜，顧正位，史 磊，黃志強，明 璐，孫琪琪

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

天龍，又名守宮，為壁虎科動物無蹼壁虎(GeckoswinhoanaGunther.)或多疣壁虎(G.japonicumDumeril.etBibron.)的干燥全體[1]，夏天秋天的時候?qū)ζ溥M行捕捉，將其摔死或者用開水燙死，再曬干或焙干。未被《中華人民共和國藥典》(2015版)收錄，只作為地方藥使用，天龍味咸，性寒，有小毒，功用有補肺腎、益精血、祛風定驚、止咳平喘、散結解毒、通絡止痛[2]，用于中風癱瘓，風濕關節(jié)痛，骨髓炎，淋巴結結核，腫瘤。天龍的藥理作用是其無疣壁虎乙醇的提取物肌注能增強閾下劑量戊巴比妥鈉對小鼠的催眠作用；腹腔注射使小鼠轉(zhuǎn)棒爬動能力降低、自發(fā)活動明顯減少，提示壁虎有鎮(zhèn)靜催眠作用[3]。有文獻表明天龍具有抗腫瘤的作用，現(xiàn)代臨床常用于消化道等惡性腫瘤的治療[4]。臨床上的用法是將天龍炒研細粉，每服3～5分；或者是0.5～1.5錢，用水煎服。由于天龍的功效，現(xiàn)在很多制藥企業(yè)將天龍與與其相輔相成的其他中藥材和輔料加工成有效的配方和劑型，例如：骨痛消。近年研究表明，小分子生物活性肽具有較好的抗腫瘤作用[5-6]。在前期做過的研究中，發(fā)現(xiàn)天龍粉發(fā)酵后的酶解提取物抗腫瘤效果顯著[7]，而且不同酶解提取物的抗腫瘤效果有明顯差異，其中胰蛋白酶和彈性蛋白酶作用較強[8-9]。故本實驗以胰蛋白酶和彈性蛋白酶作為酶解用酶，使用正交試驗方法，根據(jù)天龍粉酶解后的蛋白質(zhì)水解度，篩選出最佳酶解工藝。

1 儀器與試藥

1.1 樣品

天龍凍干粉自制(批號:20150801)。

1.2 儀器[7]

十萬分之一電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設備廠)；UV 9100B紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；EL340i型全自動酶標儀(Molecular Davices)。

1.3 試藥

天龍凍干粉自制(批號：20150801)；胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；胰蛋白酶(3000U)、彈性蛋白酶(5000U)(上海源葉生物科技有限公司)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)；胰酶(上海碧云天生物技術有限公司)；甘氨酸(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 實驗方法

2.1 正交試驗設計

本實驗擬采用進行正交試驗法來探究天龍粉的最佳酶解工藝。選擇酶解溫度(A)、酶解時間(B)、pH值(C)、和加酶量(D)影響蛋白酶活性的四個因素，以蛋白質(zhì)的水解度為指標，進行四因素四水平L16(4)4的正交試驗如表1。

表 1 天龍粉酶解工藝正交試驗設計

2.2 氨基肽氮的含量測定[7]

2.2.1 茚三酮顯色劑的配制

稱取茚三酮約0.5 g、果糖0.3 g、Na2HPO310.0 g、KH2PO36.0 g，精密稱定，定容至100 mL，放入冰箱于4℃下冷藏。

2.2.2 標準曲線的繪制

甘氨酸約0.1 g，干燥至恒重，精密稱定的溶解后定容至100 mL，稀釋至40 μg/mL，分別取0.5、1、1.5、2、2.5 mL上述溶液定容到10 mL，配成濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的標準溶液。取4 mL標準溶液于試管中，加入茚三酮顯色劑2.00 mL，沸水浴加熱15min，同法平行空白試驗，沸水浴后，冷水冷卻，加入40%乙醇溶液10.00 mL混勻，靜置15 min，于λ570 nm處測定吸光度A，計算回歸方程并得到標準曲線。

2.2.3 天龍粉氨基肽氮含量測定

精密稱取天龍粉1 g，置250 mL的具塞錐形瓶中，按料液比1∶30，加入蒸餾水30 mL，塞緊，稱重，室溫下超聲20min，稱定重量，用水補足失重，然后用1%的鹽酸溶液和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值，放入規(guī)定溫度下的水浴鍋中，加入蛋白酶，搖勻，培養(yǎng)相應時間后，取出，在3000 r·min-1下離心10min，傾去上清液，抽濾，收集續(xù)濾液，定容至100 mL。取每種天龍粉水解液適量定量稀釋到合適的濃度，按照2.2.2的步驟測定天龍粉各提取物樣品的吸光度A，計算氨基的含量。

2.2.4 測定原料中總氮量[10]

取天龍粉藥材適量，精密稱定，加到50 mL凱氏燒瓶中，加硫酸鉀0.3 g、30%硫酸銅溶液5滴、硫酸2.0 mL，先小火后大火至溶液沸騰成澄明的綠色后，繼續(xù)加熱10min，放冷。加水2 mL，取2%硼酸溶液10 mL，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴，將凱氏燒瓶中內(nèi)容物經(jīng)由漏斗轉(zhuǎn)人蒸餾瓶中，用水少量淋洗凱氏燒瓶及漏斗數(shù)次，再加入40%氫氧化鈉溶液10mL，用少量水再洗漏斗數(shù)次，關止水夾，加熱瓶進行水蒸氣蒸餾，至硼酸液開始由酒紅色變?yōu)樗{綠色時起，繼續(xù)蒸餾約10min后，將冷凝管尖端提出液面，使蒸氣繼續(xù)沖洗約1min，用水淋洗尖端后停止蒸餾。

餾出液用硫酸滴定液(0.005 mol/L)滴定至溶液由藍綠色變?yōu)榛易仙⒌味ǖ慕Y果用空白(空白和供試品所得餾出液的容積應基本相同，70/75 mL)試驗校正。每lmL硫酸滴定液(0.005 mol/L)相當于0.1401 mg的N。

2.3 計算樣品蛋白質(zhì)水解度[7]

水解度(Degree of Hydrolysis，簡稱DH)是指蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與給定蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)的比值。按下式計算樣品蛋白質(zhì)水解度。

3 實驗結果

3.1 甘氨酸的測定結果

圖1 甘氨酸的標準曲線

3.2 正交試驗結果及分析

用半微量凱氏定氮法測定1.0000g原料中總氮含量為82.3104 mg，根據(jù)公式計算出正交試驗16次結果的水解度，結果如表2。

表2 天龍粉酶解工藝條件的正交試驗設計及結果分析

表2(續(xù))

經(jīng)spss處理后得到結果見表3。

表3 正交試驗的顯著性試驗

結果表明：通過表2可知，酶解溫度為45℃、酶解時間為5h、酶解pH值為8.5、加酶量為2500U·g-1時水解度最高。所以，由蛋白質(zhì)水解度篩選出的天龍粉混合酶的最佳酶解工藝：酶解溫度為45℃、酶解時間為5h、酶解pH值為8.5、加酶量為2500U·g-1。又根據(jù)表2中的R值和表3得知，各因素對水解度的影響程度由大到小是酶解溫度>酶解pH值>酶解時間>加酶量,即酶解溫度對水解度的影響最大，其次是酶解pH值和酶解時間，加酶量對水解度的影響最小。

4 討論

現(xiàn)代研究表明，動物藥酶解后得到的小分子活性肽，其生物活性更強，而酶則表現(xiàn)為專一性。通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，天龍粉經(jīng)胰蛋白酶或彈性蛋白酶酶解后其抑制肺腺癌細胞(A549)的作用較其他蛋白酶效果更好，故本實驗使用胰蛋白酶和彈性蛋白酶的混合酶來酶解天龍粉，并測定其酶解后的蛋白質(zhì)的水解度并通過藥理實驗驗證。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，天龍粉經(jīng)混合酶酶解后，其水解度較單一酶有所提高，推斷酶解后生成更多的小分子肽[5-6]。胰蛋白酶和彈性蛋白酶最適宜的pH值在建甌都是8.0，而它們的作用機理是在弱堿性條件下中和多種肽鍵水解過程中斷裂的羧基，而有利于水解和釋放活性小分子肽[11]。然而最佳酶解工藝為酶解溫度45℃、酶解時間5 h、酶解pH值8.5、加酶量2500U·g-1，可能是溫度對水解度的提高大于酶解pH值的影響導致。

參考文獻

[1]山東省藥品監(jiān)督管理局.山東省中藥材標準[M].濟南:山東友誼出版社,2002:273.

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[9]焦方文,王集會,鄒 龑,等.全蝎粉酶解工藝最佳用酶的初步篩選[J].時珍國醫(yī)國藥,2015(10):2407-2408.

[10]國家藥典委員會.中國藥典(2015年版) 第四部 藥典附錄[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[11]王 穎,王立娜,劉春雨,等.不同蛋白酶對天龍粉水解作用的比較研究[J].化工時刊,2017,31(2):19-21.