熒光定量PCR技術在食品包裝材料致病菌監測中的應用

雷 瓊

(貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽 550016)

現今，食品安全問題在我國矛盾突出，食品問題層出不窮，嚴重影響國民的生活健康。為了進一步加強食品安全，找出影響食品安全的因素成為解決問題的關鍵。食品包裝作為食品的外衣，污染物可通過擴散、溶解和分散進入到食品，食品包裝已成為影響食品安全性的主要因素[1]。在我國食品安全突出的大環境下，建立一種快速安全的食品包裝材檢測方法至關重要。食品包裝材料的安全性檢測主要是通過化學物理等方法進行如氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、頂空氣相色和高效液相色譜-質譜連用(HPLC-MS)等[2]。采用分子生物學方法進行包裝材料致病菌檢測就所查文獻，尚未報到。

實時熒光PCR(Quantitative Real-time PCR)是在PCR 技術基礎上建立的一種新型核酸定量技術，可進一步將熒光能量傳遞技術應用于常規的PCR 儀器中，現已成為微生物學診斷最強有力的工具[3]。該技術不僅實現了對DNA模板的定量，還具有高靈敏度、高特異性和高可靠性等優點。雷永良等在2009年將Real-time PCR技術運用于食品污染物監測中，并采用傳統細菌培養法進行對比，結果表明熒光PCR方法較傳統的細菌培養法具有更高的特異性和準確性[4]。周麗民等在2009 年至 2010 年將實時熒光定量 PCR 技術應用于臨床快速篩查致病菌，認為該法是快速篩查致病菌的理想檢測方法[5]。高濤等于2017年將免疫磁珠富集-實時熒PCR技術應用于檢測單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌 3 種致病菌，建立食品微生物及其致病因子的監測新技術[6]。張靖雯在2017年報道，熒光定量 PCR 技術已經被應用于國內外的環境監測方面，有助于環境中微生物的檢測及研究[7]。目前，熒光定量PCR已廣泛應用于食品、分子生物學、醫學及環境等多研究等領域，但尚未應用于食品包裝材料安全性檢測中。

面對國內食品安全事件日益嚴峻，備受重點關注的現狀，為了進一步保護消費者的切身利益，將熒光定量PCR技術應用于食品包裝材料中致病菌的檢測，建立一種新型快速簡便的高效檢測方法，從分子生物學角度為食品安全性檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料：食品包裝材料(空白及添加陽性菌)；試劑：基因組提取試劑盒(TaKaRa，9763)；熒光定量試劑盒(深圳生科源)；瓊脂糖(Agarose)、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑均為國產。

儀器：移液器量程覆蓋0.1～100μL共5 支(Eppendorf)；C1000TM Thermal Cycler PCR儀；Gel Doc XR凝膠成像系統(Bio-Rad)；2-16k高速冷凍離心機(Eppendorf)； DYY-4型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組提取

稱取樣品5.0 g與450 mLPBS緩沖液中，按照基因組提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，加入0.7%瓊脂糖凝膠電泳30min，利用凝膠成像系統檢測DNA純度及完整度，核酸測定儀檢測質量和濃度。

1.2.2 熒光定量PCR檢測體系

表1 熒光定量PCR反應體系

根據熒光定量試劑盒說明書反應體系為2×SYBR Primex Ex Taq 12.5μL、PCR forward primer 1μL、PCR Reverse primer 1μL、DNA模板2μL、ddH2O 8.5μL。反應體系見表1。

2 實驗結果

2.1 基因組提取結果圖

圖1 細菌基因組

由圖1可知，細菌基因組DNA提取結果正確，條帶單一且明亮整齊，無降解。點樣孔沒有亮點，表明提取的基因組DNA純度較高，沒有蛋白質和RNA污染。核酸測定儀結果顯示，OD260/OD280為1.82及1.80，滿足PCR反應要求。

2.2 熒光定量PCR結果圖

構建標準曲線，由圖2可知擴增效率為101.5%，R2為0.99。溶解峰峰型單一，無雜峰，說明無非特異性擴增。標準曲線及溶解峰結果均滿足熒光定量PCR要求，數據可信。

圖2 溶解曲線及溶解峰

熒光定量PCR結果見圖3，5～8常規樣品，其擴增曲線為直線，無Ct值，無擴增效率，表明沒有致病菌存在；1～4號添加標準菌株的樣品，其Ct≤35，出現明顯的擴增曲線，根據試劑盒說明書判定結果為陽性，實驗結果與實驗設計完全一致。

圖3 熒光定量PCR結果圖

3 結果與分析

試驗表明，實時熒光PCR 測定食品包裝材料中致病菌的結果為陽性，與預期結果一致。證明熒光定量PCR技術可用于食品包裝材料致病菌檢測。實驗結果可知，本方法具有準確度高、過程簡單安全、節省人力及實驗耗材、重復性好等特點，能夠快速高效地測定批量的樣品。

近年來，食品安全事件頻發，目前檢測病原細菌的方法主要是細菌學培養法，要經過富集培養、生理生化鑒定、形態觀察等。趙琢等在2013年采用多重PCR的方法對食品包裝材料中對沙門氏菌的檢測，取得了較為滿意的檢測靈敏度[8]。本研究建立的熒光定量PCR 方法可完成對多種致病菌的檢測，與傳統的細菌學培養法及普通PCR技術相比較，步驟簡單，具有更高的特異性和靈敏度，更加簡便經濟，具有更高的應用價值，為食品包裝材料中致病菌檢測提供了一種分子生物學技術，對于提升食源性致病菌的綜合檢測能力，滿足國家食品包裝及食品檢驗中心的建設需求具有重要意義，為今后食品包裝材料的安全性檢測科研數據等奠定基礎[9]。

參考文獻

[1]唐 玉,張峻嶺.食品包裝安全分析[J].食品界,2016(6):26-27.

[2]秦 蓓.塑料食品包裝材料安全性研究現狀[J].包裝工程,2011(19):33-37.

[3] Sachse K.Specificity and performance of diagnostic PCR assays[J].Methods in Molecular Biology,2003,216(216):3-29.

[4]雷永良,王曉光,葉碧峰,等.實時熒光定量PCR技術在食品污染物監測中的應用[J].中國衛生檢驗雜志,2009(4):828-830.

[5]周麗民,雷永良,王小光,等.實時熒光定量PCR技術在致病菌檢測中的應用[J].標記免疫分析與臨床,2012,19(5):296-299.

[6]高 濤,張麗萍,魏 雯,等.免疫磁珠富集-實時熒光PCR技術在食源性致病菌監測中的應用研究[J].醫學動物防制,2017(1):18-20.

[7]張靖雯.熒光定量PCR技術在環境微生物檢測中的應用研究[J].智庫時代,2017(5):43-45.

[8]趙 琢,栗建永,賈曉川,等.食品接觸材料中沙門氏菌的多重PCR檢測方法[J].食品研究與開發,2013(24):193-196.

[9]左澤彥,孫端方.實時熒光PCR檢測食品中牛及豬源性成分[J].貴州農業科學,2016,44(4):130-132.