丙型肝炎病毒和絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型的關系研究

周靜娣 高國生 劉興暉 胡耀仁

315010寧波市第二醫院(周靜娣、高國生、胡耀仁)；200135上海市浦東新區公利醫院(劉興暉)

全世界有超過1.7億人感染丙型肝炎病毒(hepatctis C virus,HCV),嚴重危害人類健康[1]。絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 1型(SPINK1)是一種炎性蛋白,以較高的濃度存在于胰腺和胰液中,在健康人群中,肝臟是SPINK1的主要來源。研究表明,SPINK1在肝癌患者表達水平升高[2],HCV是導致原發性肝癌的主要誘因之一,但目前為止,HCV對SPINK1的調節作用還不是很清楚。本研究旨在探討HCV對SPINK1的調節作用及其臨床意義,為HCV相關疾病的診治提供一定的理論基礎。

1 對象與方法

1.1 一般資料收集HCV感染的患者92例,包括男性53例,女性39例,平均年齡51.8±20.3歲。選取86例健康體檢者作為對照組,其中男性49例,女性37例,平均年齡42.2±15.7歲,所有患者均排除其他嗜肝病毒感染,且均未接受干擾素(IFN)和直接抗病毒(DAA)藥物抗病毒治療。

1.2 試劑含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞由本室保存[3]；M-MLV逆轉錄酶購自美國Promega公司；SPINK1單克隆抗體購自購自美國美國Sigma公司；SPINK1 ELISA檢測試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養：Huh7.5.1細胞培養在含10%的胎牛血清(含100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素)DMEM培養基中,在37℃,5%的CO2細胞培養箱中進行培養,每個實驗組做3個復孔。

1.3.2 RT-PCR檢測：提取含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞及其對照細胞的總RNA,MMLV逆轉錄酶反轉錄成cDNA,SPINK1基因的檢測引物：上游引物：5’-TAACAGGCATCTTTCTTCT-3’；下游引物：5’-AGTATTTCCATCAGTCCC-3’,進行PCR擴增,同時設立β-actin作為對照[2],產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 Western blot(WB)：細胞裂解液裂解Huh7.5.1細胞,加入上樣緩沖液后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,將蛋白轉至NC膜上,分別加入SPINK1單克隆抗體(1∶2 000)和羊抗兔多克隆抗體(1∶5 000),設立β-actin作為對照,采用底物化學發光(ECL)進行顯色。

1.3.4 ELISA檢測：細胞上清及血清SPINK1的含量采用ELISA進行檢測,操作按照說明書進行,實驗重復3次。

1.4 統計學方法數據分析采用SPSS16.0軟件,SPINK1含量以均數±標準差(±s)表示,各組間均數的比較采用t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

圖1 RT-PCR檢測SPINK1 mRNA的表達Fig.1 Expression of SPINK1 mRNA determined by RT-PCR

圖2 Western blot檢測SPINK1蛋白的表達Fig.2 Expresssion of SPINK1 protein detected by Western blot

圖3 感染HCV的Huh7.5.1細胞與對照細胞上清中SPINK1的含量比較(?P＜0.05)Fig.3 Comparison of SPINK1 content of Huh7.5.1 cells infected with HCV and control cell supernatant(?P＜0.05)

2.1 HCV上調SPINK1 mRNA和蛋白的表達我們采用RT-PCR和WB檢測了JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對照細胞SPINK1 mRNA和蛋白的表達,結果表明,感染了HCV的Huh7.5.1細胞SPINK1 mRNA和蛋白的表達水平升高。見圖1和圖2。細胞上清中SPINK1檢測結果顯示,感染了HCV的Huh7.5.1細胞SPINK1含量(58.7±16.2μg/L)明顯高于對照細胞(41.2 ±10.5μg/L),統計學分析有顯著性差異(P=0.016)。見圖3。

2.2 HCV感染患者SPINK1血清水平升高為證實HCV對SPINK1的調節作用,我們采用ELISA檢測了HCV患者和正常對照組SPINK1的血清含量。結果表明,與對照組相比(17.9±4.5μg/L),SPINK1含量在丙肝患者組明顯升高(67.5±19.8 μg/L),(P=0.016)。見圖4。同時,Spearman相關分析顯示年齡與SPINK1血清學水平之間無相關性(r=0.116,P＞0.05)。

3 討論

圖4 正常對照組和HCV患者組SPINK1的血清水平比較(?P＜0.05)Fig.4 Comparison of serum levels of SPINK1 of the normal control group and HCV patients group

SPINK1又被稱為腫瘤相關胰蛋白酶抑制劑(TATI)和胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(PSTI),是一種分泌性多肽,位于5號染體(5q32),基因組約為7.5 kb,基因產物由79個氨基酸組成,其主要生理功能是抑制胰蛋白酶原等多種絲氨酸蛋白酶原活性,拮抗胰腺等組織的“自身消化”[4-5]。研究表明,SPINK1在乙肝病毒(HBV)和HCV患者肝組織表達升高[6],但HCV能否在細胞水平調節SPINK1的表達還不清楚。

本研究檢測了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞株及其對照細胞mRNA和蛋白表達水平,結果顯示,HCV能夠在轉錄和翻譯水平上調SPINK1的表達。SPINK1是分泌性蛋白,細胞上清檢測結果也顯示含JFH-1株 HCV病毒感染的Huh7.5.1細胞株高于對照細胞,表明HCV能夠在細胞水平促進SPINK1的合成和分泌,進一步的血清檢測結果發現,HCV患者SPINK1的血清含量明顯高于正常對照組(因正常對照組和患者之間的年齡存在差異,為避免表達水平的差異是由于年齡原因導致的,故進一步對年齡與SPINK1血清水平之間的相關性作了分析,結果證明兩者之間無相關性),證實了HCV能夠在體內外上調SPINK1的表達。

需要指出的是,IFN和直接抗病毒(DAA)藥物是臨床治療HCV的常用藥物,但目前未見抗病毒藥物對SPINK1表達影響的相關報道,因此,本研究我們選取了未接受干擾素(IFN)和直接抗病毒(DAA)藥物抗病毒治療HCV患者。

HCV感染是肝癌的主要誘因之一,病毒與宿主的相互作用在肝癌的發生機制中起重要作用[7],病毒感染機體后誘發機體誘發宿主免疫反應、炎癥反應,最終導致肝細胞大量重生而誘發致癌效應[8]。Lu X等證實SPINK1能夠抑制細胞的凋亡[9],同時,HCV的復制能夠促進SPINK1的表達[6],本研究也證實了HCV在體內外上調SPINK1的表達,因此,HCV感染宿主肝細胞后,通過促進SPINK1的表達來抑制肝細胞凋亡,以利于HCV在肝細胞內不斷的復制和機體持續的炎癥反應,從而促進肝癌的發生[5]。

研究證實,SPINK1的表達水平與肝癌進程相關,高水平SPINK1對于肝癌的早期診斷及術后復發有一定的預測作用[2],因此,血清中SPINK1的檢測將為HCV相關疾病的診治提供線索。

總之,本研究探討了HCV對SPINK1的調節作用,為揭示HCV的致癌機理奠定了一定基礎,但HCV調節SPINK1表達的具體分子機制及IFN對SPINK1表達的影響有待進一步研究。

利益沖突無