2009—2011年南京地區兒童急性呼吸道感染人冠狀病毒HKU1和NL63臨床與流行病學特征

閆坤龍 謝志萍 高寒春 高小倩 金玉 段招軍

210008,南京醫科大學附屬兒童醫院消化科(金玉、閆坤龍)；100052北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(謝志萍、高寒春、段招軍)

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)是世界范圍內嬰幼兒發病和死亡的主要原因,是導致5歲以下嬰幼兒死亡的首要病因[1],在兒童的急性呼吸道感染病原中90%以上是由病毒性病原引起,冠狀病毒是主要致病原之一[2]。人冠狀病毒分型包括20世紀60年代發現的冠狀病毒OC43和229E；21世紀初發現的冠狀病毒HKU1和NL63,以及具有強烈傳染性的冠狀病毒SARS和MERS[3]。冠狀病毒HKU1和NL63作為近些年發現新型冠狀病毒在南京地區的臨床和流行病學資料較少,特別是關于兒童急性呼吸道感染疾病的研究,因此,本研究于2009年8月份至2011年7月份對南京地區兒童冠狀病毒HKU1和NL63的感染情況進行了研究,對比分析了本地區兩種病毒在兒童中的臨床和分子流行病學特征。

1 材料與方法

1.1 研究對象與標本采集

1.1.1 研究對象：2009年8月份至2011年7月份,收集因急性呼吸道感染于南京醫科大學兒童醫院就診和住院的患兒呼吸道分泌物標本1 286份,其中鼻咽抽吸物標本795份,咽拭子標本491份。

1.1.2 標本采集：對于鼻咽抽吸物標本采集：使用一次性無菌吸痰管對納入研究的患兒在就診當天經單側鼻腔插入,深度7～8 cm,負壓吸取咽部分泌物1～2 ml,置于無菌采集管內,在超凈工作臺內加入2 ml病毒保存液(含青霉素、鏈霉素和兩性霉素B濃度均為200 U/ml,0.125%BSA),旋渦振蕩器上震蕩混勻,置于-80℃低溫冰箱保存至檢測。對于咽拭子標本采集：以無菌棉拭子吸附無菌生理鹽水,采集兩側腭弓、咽部或扁桃體黏膜上的分泌物,放入含2 ml病毒保存液的滅菌凍存管中,置于-80℃低溫冰箱保存至檢測。本研究經南京醫科大學附屬兒童醫院醫學倫理委員會批準,征得患兒監護人知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本處理和病毒RNA提取：將采集的樣本室溫溶解,置旋渦振蕩器上充分振蕩混勻,1 500×g離心10 min,吸取上清,使用QIAmp病毒RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取病毒RNA,操作步驟嚴格參照說明書。

1.2.2 HCoV-HKU1和HCoV-NL63核酸檢測：提取的RNA以隨機引物,采用反轉錄酶SuperScript?Ⅱ(美國Invitrogen公司)反轉錄合成cDNA后進行病毒檢測。具體操作方法參考文獻[4-5],每次反應均設立陽性、陰性對照。擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,陽性產物進行核苷酸序列測定,弱陽性標本經QIAquick DNA凝膠純化回收試劑盒(德國Qiagen公司)純化回收后,使用T4連接酶連接到pGEM-T載體(美國 Promega公司)置于4℃環境中過夜,然后將連接產物轉化感受態細胞DH5a,將篩選為陽性克隆的菌落挑取后培養的菌液進行核苷酸序列測定。

1.3 序列測定及分析測序反應由商業測序公司完成。使用DNAman軟件編輯測序序列,序列分析采用美國生物醫學信息中心(NCBI)的在線工具Blast,并采用MEGA7.0軟件繪制基因的系統進化樹。比較和進化分析所采用的基因序列GenBank序列號如下：HCoV-HKU1(NC-006577,DQ415914,DQ415911,DQ415912)；HCoV-NL63(AY567487,KF530113,KF530110)；HCoV-OC43(KX344031,KF530098)； HCoV-229E(NC-002645)；PEDV(NC-003436)；TGEV(NC-002306)；FIPV(NC-002306)；MHV(AF201929)；BCoV(NC-003045)；HCoV-SARS(AY274119)；HCoV-MERS(KT225476)。

1.4 混合感染分析經檢測為HCoV-HKU1或HCoV-NL63陽性標本,采用PCR或RT-PCR方法,進行其他常見呼吸道病毒檢測[6],包括腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒(IFVA和 IFVB型)、副流感病毒(PIV1-3型)、偏肺病毒(HMPV)以了解病毒性病原混合感染的情況；同時對鼻咽抽吸物標本進行了細菌學培養,以了解細菌性病原混合感染情況。

1.5 臨床資料分析臨床資料調查表為根據研究設計的統一表格,由采集標本者在采集標本后填寫,結合檢測結果,對HCoV-HKU1和HCoV-NL63在呼吸道感染兒童中的臨床和流行病學特點進行總結分析。

1.6 統計學方法統計學處理采用SPSS 21.0軟件,計量資料采用秩和檢驗,對于計數資料以Chisquare檢驗或校正Chi-square檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 一般資料2009年8月份至2011年7月份共收集1 286份,男性患兒876例,女性患兒410例,男女之比為2.1∶1；鼻咽抽吸物標本795份,咽拭子標本491份,門診采集樣本432例,其中上呼吸道感染339例,下呼吸道感染93例,住院采集樣本854例,均為下呼吸道感染。HCoV-HKU1和NL63總檢出率為2.6%(33/1 286),其中檢測到HCoV-HKU1陽性擴增產物14份,檢出率為1.1%(14/1 286),HCoV-NL63的陽性擴增產物19份,檢出率為1.5%(19/1 286)。

在HCoV-HKU1陽性病例中,男性患兒10例,女性患兒4例,性別差異在病毒檢出率中無統計學意義(χ2=0.067,P＞0.05)。432例門診患兒檢出HKU1核酸陽性5例,854例住院患兒檢出HKU1核酸陽性9例,門診和住院患兒檢出率之間差異無統計學意義(χ2=0.029,P＞0.05)。陽性病例中位數年齡為6.8月(1.4月～43月)。其中6個月以下患兒369例,HKU1核酸檢出6例,陽性率1.6%,6個月～12月患兒279例,檢出5例,陽性率1.8%,1歲～3歲患兒285例,檢出2例,陽性率為0.7%,4歲～6歲患兒266例,檢出1例,陽性率為0.38%,6歲以上患兒87例,無陽性標本(季節分布情況見圖1)

在HCoV-NL63陽性病例中,男性患兒11例,女性患兒8例,性別的差異在病毒檢出率中無統計學意義(χ2=0.928,P＞0.05)。432例門診患兒檢出HCoV-NL63核酸陽性12例,854例住院患兒檢出HCoV-NL63核酸陽性7例,門診和住院患兒檢出率之間差異具有統計學意義(χ2=146.9,P＜0.05)。陽性病例中位數年齡為14個月(3.6個月～76個月),其中6個月以下患兒369例,HCoV-NL63核酸檢出3例,陽性率0.8%,6個月～12個月患兒279例,檢出3例,陽性率1.1%,1歲～3歲患兒285例,檢出10例,陽性率為3.5%,4歲～6歲患兒266例,無陽性標本,6歲以上患兒87例,檢出1例,陽性率為1.1%。(季節分布情況見圖1)

圖1 冠狀病毒HKU1和NL63檢出的季節分布Fig.1 Seasonal distribution of coronavirus HKU1 and NL63

2.2 臨床特征分析HCoV-HKU1核酸陽性標本均采集于下呼吸道感染病例,臨床診斷包括支氣管炎7例、支氣管肺炎6例、毛細支氣管炎1例,臨床癥狀為咳嗽(100%,14/14)、發熱(64.3%,9/14)、喘息(57.1%,8/14)、咳痰(57.1%,8/14)；臨床體征為呼吸音增粗(100%,14/14),喘鳴音(50.0%,7/14),痰鳴音(21.4%,3/14),細濕啰音(21.4%,3/14),氣促發紺(7.1%,1/14),鼻導管吸氧1例,中位數住院日8 d。無死亡病例。(表1)

HCoV-NL63核酸陽性病例包括門診上呼吸道感染11例和下呼吸道感染1例,住院下呼吸道感染病例7例,臨床診斷為急性上呼吸道感染(57.9%,11/19)、支氣管肺炎(31.6%,6/19)、支氣管炎(5.3%,1/19)、毛細支氣管炎(5.3%,1/19),臨床表現為發熱(78.9%,15/19)、咳嗽(47.4%,9/19)、咳痰(47.4%,9/19)、喘息(21.1%,4/19)；臨床體征為呼吸音增粗(52.6%,10/19),喘鳴音(26.3%,5/19),痰鳴音(26.3%,5/19)。中位數住院8 d。無死亡病例。(表1)

HCoV-HKU1與HCoV-NL63陽性病例組間比較臨床癥狀、體征和輔助檢查無統計學差異(P＞0.05)；門診與住院病例、呼吸道感染部位在組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。(表1)

2.3 混合感染分析在14份HKU1核酸陽性病例中,1例為單獨感染,13例為病毒性病原的混合感染,病毒性病原的混合感染率92.9%,其中5例為3種病毒混合感染,8例為2種病毒混合感染,最常見的混合感染病毒為人呼吸道合胞病毒(6例),人副流感病毒3型(5例),人腺病毒和人偏肺病毒(各2例)。HKU1陽性病例中9例有細菌混合感染,其中混合感染流感嗜血桿菌4例,肺炎鏈球菌3例(其中1例混合感染金黃色葡萄球菌),卡他布蘭漢菌和聚團泛菌各1例。

表1 HKU1和NL63感染病例的臨床特征Tab.1 Clinical features of coronavirus HKU1 and NL63 infection cases

在19份NL63核酸陽性病例中,7例為單獨感染,12例為病毒性病原的混合感染,病毒性病原的混合感染率為63.2%,其中2例為3種病毒混合感染,10例為2種病毒混合感染,最常見的混合感染病毒為人腺病毒4例,流感病毒A型3例,人博卡病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人副流感病毒1、2、3型和人偏肺病毒各1例。NL63陽性病例中,7例行細菌培養4例有細菌混合感染,其中肺炎鏈球菌、產酸克雷伯菌、奇異變形菌、奈瑟氏菌各1例。

2.4 基因檢測及分析本研究共檢測出冠狀病毒HKU1陽性擴增產物14份,均在490 bp左右處表現為單一特異性條帶,與預期目的片段聚合酶基因pol片段相符,陽性樣本的測序結果GenBank中HCoVHKU1基因序列進行Blast比對,核苷酸同源性在98.2%～100%之間。在陽性標本中,2010年采集標本檢出6份,其中A基因型5例,B基因型1例；2011年采集標本檢出8例,A基因型1例,基因型B型7例。冠狀病毒NL63的陽性擴增產物19份,均在250 bp左右處表現為單一特異性條帶,與預期目的片段N基因片段相符,2009年所采集標本檢出13例,2010年所采集標本檢出3例,2011年所采集標本檢出3例,陽性樣本的測序結果與GenBank中HCoV-NL63基因序列進行Blast比對,核苷酸同源性在95.6%～100%之間。

3 討論

本研究結果顯示2009—2011年的連續兩年的流行病學篩查 HCoV-HKU1和 NL63總檢出率為2.6%(33/1 286),HCoV-HKU1檢出率為1.1%(14/1 286),HCoV-NL63的檢出率為1.5%(19/1 286)。目前世界各地相繼報道有 HCoV-HKU1和HCoV-NL63檢出,陽性率在1% ～10%[7]。HCoVHKU1在各季節均有檢出,嬰幼兒的感染風險較高,臨床診斷以肺炎居多。與其他呼吸道病毒混合感染較常見。

本研究HCoV-HKU1檢出率1.1%,較蘭州地區的檢出率為低[8],低于以往南京地區報道冠狀病毒的總檢出率,但是高于其10歲以下人群的檢出率[9],在檢出率、季節分布、人群分布與武漢地區兒童人群報道相似[10]。本研究HCoV-HKU1陽性病例均在下呼吸道感染患兒中檢出,與湖南以往研究一致[11],表明其可能引起病情較重的下呼吸道感染,但因混合感染率92.9%,所以有待更進一步的研究明確其致病性。病毒性病原混合感染分析人呼吸道合胞病毒和人副流感病毒3型是其主要的混合感染病毒性病原,本研究結果與蘭州地區的報道一致[8]。本組HCoV-HKU1陽性標本主要分布在冬春季,人群分布以1歲以下嬰幼兒為主,隨著年齡增長檢出率呈下降趨勢。感染患兒的臨床表現無特異性。HCoV-NL63檢出率1.5%,與南京地區報道的10歲以下人群的檢出率比較為高[9],本組HCoVNL63陽性標本主要分布在夏季和秋季,在8～9月份出現流行高峰,人群分布主要在1歲～3歲幼兒,感染患兒的臨床表現無特異性。本研究較蘭州地區報道的檢出率低,但季節分布、人群分布相似[12],但是與廣州地區在夏季和冬季呈雙流行高峰的季節分布特點不同[13],分析本研究報道與蘭州地區檢出率的差異、廣州地區流行特點的不同可能與地理及氣候因素有關；與本地區以往報道的差異可能由研究人群的構成不同所導致。本研究HCoV-NL63陽性病例病毒性病原的混合感染率為63.2%,最常見合并感染病毒性病原為人腺病毒和流感病毒A型,分析原因可能是HCoV-NL63與人腺病毒和流感病毒A型流行季節重疊有關。

HCoV-HKU1首次被發現于患有呼吸道和心血管系統基礎疾病的老年人群中[14],中國香港地區報道11例兒童感染患兒,8例有基礎疾病；同樣,美國報道的9例HCoV-HKU1感染患兒,5例患有基礎疾病[15]。以上研究表明HCoV-HKU1感染可能會導致基礎疾病的加重而需要住院治療,受感染人群主要為免疫力低下者。本研究的14例HCoV-HKU1感染患兒均為住院患兒,14例陽性病例有11例患兒的年齡小于1歲,因嬰幼兒免疫力尚未發育成熟,故研究結果同樣證實HCoV-HKU1感染主要影響免疫力低下的人群。HCoV-NL63感染與呼吸道疾病的致病性已經明確,可引起相對溫和的呼吸道感染癥狀如發熱、咳嗽、咽痛和流涕[16]。本研究HCoVNL63陽性患兒以上呼吸道感染為主,研究結果與上述報道大致類似。

我們采用RT-PCR方法擴增HCoV-HKU1聚合酶pol和HCoV-NL63的N基因片段,共檢測到33份陽性標本,其中 HCoV-HKU1陽性標本14份,HCoV-NL63陽性標本19份,經測序分析分析與已公布的標準株序列同源性在98.2% ～100%和95.6%～100%之間,證實其為冠狀病毒 HCoVHKU1和HCoV-NL63。經過進一步系統進化分析結果表明,14例HCoV-HKU1核酸陽性樣本種A基因型6例,B基因型8例,在連續2年的研究中表現出2種基因型交替流行的特點；HCoV-NL63則表現為單一基因型的流行。

綜上所述,通過對南京地區急性呼吸道感染患兒呼吸道分泌物中HCoV-HKU1和HCoV-NL63基因的檢測和基因分析初步掌握了該病毒在本地區的臨床和流行病學特征,由于HCoV發病率較低,陽性病例數較少,加之本研究的時間短,尚不能完全明確其在兒童急性呼吸道感染中的整體性規律,需進一步大樣本長時間的廣泛深入研究,以更好地了解HCoV在兒童急性呼吸道感染中的病原學作用和流行病學特征。

利益沖突無