不同粒度花椒籽黑種皮粉理化特性

楊 沫，薛 媛，任 璐，雷宏杰*，徐懷德*

花椒為蕓香科花椒屬植物，其果皮是中國傳統的“八大調味品”之一。花椒籽作為花椒果皮生產中的副產物，產量是花椒果皮的1.2 倍，其年產量高達30萬 t，對花椒籽的利用主要集中在花椒籽油[1-2]和蛋白質方面[3-4]。花椒籽種皮為黑色，易剝離收集，可作為天然黑色素原料，而且還具有抗氧化等功能[5-6]，但長期以來沒有得到合理利用，被當作燃料燃燒或當作廢物丟棄，既浪費資源，又污染環境。

種皮的利用主要集中在對其活性物質的提取及其功能性質的研究方面，如李紅姣等[7]研究發現山杏種皮黑色素具有較強的螯合金屬離子能力和清除羥自由基能力等。李芳[8]和Jhan[9]等的研究均表明黑豆種皮中花色苷類色素的提取物具有一定的抗氧化能力。此外，Chávez-Santoscoy等[10]將黑豆種皮中提取的花青素等活性物質添加到餅干中。王洪政[11]和孟慶煥[12]等用牡丹種皮中黃酮類物質對2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基清除能力和抗凝血作用進行研究。

超微粉碎技術為一種新型食品加工技術，可使粉體具有較好的分散性、吸附性、生物活性和化學活性[13-16]，已應用于花粉、甘草、黑木耳等材料的超微粉碎加工中。張麗華等[17]研究發現木瓜超微粉對膽酸鈉和重金屬離子具有較強的吸附能力；張榮等[18]發現超微粉碎可以顯著提高黃芪粉體的流動性、持水性、吸附性、膨脹力和容積密度，同時增加了黃芪總黃酮的溶出度。

關于不同粒度花椒籽黑種皮粉的研究鮮見報道。因此，本實驗通過超微粉碎和常規粉碎制得超微粉、細粉和粗粉3 種不同粒度的花椒籽黑種皮粉，對不同粒度花椒籽黑種皮粉的理化特性進行研究，為花椒籽黑種皮在食品和藥品工業中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽黑種皮采自陜西韓城。

過硫酸鉀 國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 西隴化工有限公司；沒食子酸、蘆丁、福林-酚試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、ABTS、VC美國Sigma公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CJM-SY-B高能納米沖擊磨 秦皇島太極環納米制品有限公司；MJ-04多功能粉碎機 上海浦恒信息科技有限公司；Mastersizer 2000E激光衍射粒度分析儀英國馬爾文公司；CM-5色差計 科電貿易（上海）有限公司；Vetex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；UV-1780紫外-可見分光光度計 日本島津公司；SB-500DTY超聲波清洗器 寧波新芝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒籽黑種皮前處理

花椒籽黑種皮脫脂：將花椒籽黑種皮用石油醚以1∶3（m/V）的料液比脫脂處理24 h后抽濾、烘干，得到脫脂后的花椒籽黑種皮。

1.3.2 花椒籽黑種皮粉制備

花椒籽黑種皮超微粉：500 g花椒籽黑種皮放入高能納米沖擊磨中，球磨介質為氧化鋯球，球料體積比2∶1，介質氧化鋯球直徑為12 mm，冷卻介質為水，粉碎過程中溫度為16 ℃，粉碎時間為5 h得到超微粉[12]。

花椒籽黑種皮細粉：將花椒籽黑種皮用MJ-04多功能粉碎機粉碎，過120 目的標準篩，按粒度大小將大于120 目的定義為細粉。

花椒籽黑種皮粗粉：將花椒籽黑種皮用MJ-04多功能粉碎機粉碎，分別過40、120 目的標準篩，按粒度大小將40～120 目的定義為粗粉。

將粉碎好的花椒籽黑種皮粉密封后放入干燥器中保存。

1.3.3 花椒籽黑種皮粉成分測定

粗蛋白的測定：參照GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》；粗脂肪的測定：參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》；粗多糖的測定：參照苯酚-硫酸法；總灰分的測定：參照GB/T 12729.7—2008《香辛料和調味品 總灰分的測定》。

1.3.4 花椒籽黑種皮粉粒徑測定

花椒籽黑種皮粉粒度使用Mastersizer 2000E激光衍射粒度分析儀測定。取適量花椒籽黑種皮粉將其分散于蒸餾水中進行測定。儀器測定方式采用濕法測定。

D10、D50和D90表示樣品的累積粒度分布百分數達到10%、50%和90%時所對應的粒徑。其中D50表示花椒籽黑種皮粉的平均粒徑。按式（1）計算粒度分布離散度。

1.3.5 花椒籽黑種皮粉掃描電子顯微鏡圖像分析

將3 種樣品用雙面膠固定在載物片上，噴金處理后使用S-3400N掃描電子顯微鏡獲取花椒籽黑種皮粉放大500 倍的掃描電子顯微鏡圖像。

1.3.6 花椒籽黑種皮粉中紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法。將樣品與溴化鉀以1∶100的比例置于瑪瑙研缽中研磨，混合均勻，用壓片機制成透明薄片，放入Vetex 70傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描。

1.3.7 花椒籽黑種皮粉色澤測定

色差儀經標準黑板、白板校正后，對置于透明比色皿中的花椒籽黑種皮粉進行檢測，以獲得L*、a*和b*值。

1.3.8 花椒籽黑種皮粉持水力和持油力測定

持水力測定[19]：準確稱取不同粒度樣品干粉末1.00 g于50 mL燒杯中，加入30 mL的蒸餾水，放在60 ℃水浴鍋中水浴1 h，取出冷卻，在6 000 r/min離心20 min，除去上層水分后，殘留物稱質量。重復實驗3 次，取其平均值。按照式（2）計算持水力。

持油力測定[20]：分別取1.00 g粉體于離心管中，加入30 g植物油，在60 ℃水浴鍋中水浴1 h，取出冷卻，在6 000 r/min離心20 min，除去上層油脂后，殘留物稱質量。重復實驗3 次，取其平均值。按照式（3）計算持油力。

1.3.9 花椒籽黑種皮粉重金屬離子吸附性測定

取不同粒度的花椒籽黑種皮粉各0.05 g（m）于50 mL（V）錐形瓶中，加入25 mL不同質量濃度的Pb2+溶液（ρ0分別為30、50、70、90 mg/L），35 ℃下恒溫振蕩6 h后過濾，取上清液用原子吸收分光光度計測定Pb2+質量濃度（ρ1/（mg/L）），按式（4）計算Pb2+的吸附量。

1.3.10 花椒籽黑種皮粉多酚和黃酮含量測定

1.3.1 0.1 乙醇提取液制備

準確稱取8.0 g不同粒度的花椒籽黑種皮粉于250 mL錐形瓶中，加入200 mL體積分數60%乙醇溶液超聲輔助提取1 h，離心取上清液，將其保存于冰箱中待用。

1.3.1 0.2 花椒籽黑種皮中多酚含量測定

花椒籽黑種皮粉多酚含量的測定[21]。標準曲線的繪制：精確稱取沒食子酸0.050 0 g，用蒸餾水定容至50 mL容量瓶，使母液質量濃度為0.1 mg/mL。準確量取0.0、0.1、0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5 mL母液于25 mL具塞試管中，用蒸餾水補至10 mL，然后加入0.5 mL福林-酚試劑和2.5 mL體積分數20%碳酸鈉溶液，室溫避光靜置1 h后，加蒸餾水至25 mL，以不加沒食子酸溶液為空白對照，于725 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。沒食子酸標準曲線：y＝0.110 3x+0.018 4（R2＝0.999 1）。

花椒籽黑種皮多酚含量測定：精確移取0.5 mL乙醇提取液于25 mL具塞試管中，按上述方法測定吸光度。根據標準曲線，確定其質量濃度。樣品中的多酚含量以1 g干基中所含沒食子酸的質量表示（mg/g md）。

1.3.1 0.3 花椒籽黑種皮中黃酮含量測定

花椒籽黑種皮粉黃酮含量的測定[22]。標準曲線的繪制：精確稱取蘆丁0.010 0 g，用體積分數60%乙醇溶液定容至50 mL容量瓶，使母液質量濃度為0.2 mg/mL。準確量取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL母液于10 mL具塞試管中，分別加入質量分數5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入質量分數10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加體積分數4%氫氧化鈉溶液4 mL，再用體積分數60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻、靜置15 min，以不加蘆丁溶液為空白對照，于510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。蘆丁標準曲線方程：y＝0.010 1x-0.001 1（R2＝0.999 6）。

花椒籽黑種皮黃酮含量測定：精確移取1.5 mL乙醇提取液于10 mL具塞試管中，按上述方法測定吸光度。根據標準曲線，確定其質量濃度。樣品中的黃酮含量以1 g干基中所含蘆丁的質量表示（mg/g md）。

1.3.11 抗氧化活性的測定

1.3.1 1.1 DPPH自由基清除能力測定

取不同樣品的乙醇提取液0.24 mL加入2.4 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，再加入無水乙醇補足至5 mL，混勻后在黑暗條件下靜置30 min，于517 nm波長處測定各樣品的吸光度，平行測定3 次，取平均值，按式（5）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度（以乙醇代替樣品液）；A為樣品組的吸光度；A1為樣品溶液本身的吸光度（以無水乙醇代替顯色劑）。

另以不同質量濃度（0～0.2 g/L）的VC清除DPPH自由基的能力作標準曲線，計算花椒籽黑種皮粉的VC當量抗氧化能力（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity，AEAC）。VC標準曲線方程為：y＝452.6x-0.834 1（R2＝0.999 2）。

1.3.1 1.2 ABTS+·清除能力測定

將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合使之反應并置于暗處12～16 h以制備ABTS+·。用無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋直至其在波長734 nm處的吸光度為0.70±0.02。將50 μL不同樣品的乙醇提取液加入到5 mL稀釋后的ABTS+·溶液中，室溫避光反應10 min，于734 nm波長處測定吸光度，平行測定3 次，取平均值，ABTS+·的清除率按式（6）計算。

式中：A0為空白對照液的吸光度（以乙醇代替樣品液）；A為樣品組的吸光度；A1為樣品溶液本身的吸光度（以無水乙醇代替顯色劑）。

另以不同質量濃度（0～0.3 g/L）的VC清除自由基的能力作標準曲線，計算花椒籽黑種皮粉的AEAC。VC標準曲線方程為：y＝241.39x-0.305 5（R2＝0.999 5）。

1.4 數據分析

每組實驗重復3 次，數據分析采用Minitab 16軟件進行，結果以平均值±標準差表示，多重比較采用Tukey法，顯著性水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同粒度花椒籽黑種皮粉成分

表1 不同粒度花椒籽黑種皮粉的基本成分Table 1 Proximate composition of black seed coat powders of pepper with different particle sizes

由表1可知，花椒籽黑種皮粉中的脂肪、蛋白質、總糖和灰分含量隨著粉體粒度的減小而逐漸增加。說明超微粉碎可以最大限度的保留粉體的營養成分[23]。可能的原因是超微粉碎處理后，細胞組織的破壁較充分，一是使原料的表面積和孔隙率變大；二是使以聚集狀態存在的營養物質相互分開，變成游離狀態[24]。

2.2 不同粒度花椒籽黑種皮粉粒徑

表2 花椒籽黑種皮粉的粒徑Table 2 Particle sizes of black seed coat powders of pepper

由表2可知，花椒籽黑種皮超微粉的D10、D50和D90都顯著小于花椒籽黑種皮粗粉和細粉的粒徑，表明超微粉碎可以有效降低花椒籽黑種皮粉的粒度。鑒于植物細胞的尺度為8～90 μm[25]，可以看出和另外兩種粉體相比，花椒籽黑種皮超微粉的粒度已達到細胞級粉碎。

離散度的大小表示顆粒分布范圍的均勻程度，其越小越好。隨著花椒籽黑種皮粉粒徑的減小，其顆粒離散度呈先減小后增大的趨勢，一方面是因為超微粉碎不完全，粒徑分布不均勻；另一方面是粒徑減小至一定程度后，粉體表面的吸附性增強，相互之間的作用力，如范德華力、靜電力增大，更容易發生分子間聚集[26-27]，導致超微粉碎后花椒籽黑種皮粉的離散度上升。

2.3 不同粒度花椒籽黑種皮粉掃描電子顯微鏡圖像分析

圖1 不同粒度花椒籽黑種皮粉的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 1 Scanning electron micrographs of black seed coat powders of pepper with different particle sizes

掃描電子顯微鏡圖像可直觀反映花椒籽黑種皮粉的微觀結構[28]。由圖1可以發現，花椒籽黑種皮粗粉和細粉的組織結構完整。其中花椒籽黑種皮粗粉顆粒較大、表面結構清晰，細粉顆粒中小塊顆粒較多，但仍有完整的組織結構。而花椒籽黑種皮超微粉呈現細小顆粒碎片，組織結構和細胞壁被破壞，但團聚現象較嚴重，呈現出表觀粒徑增大、分布密集的現象，這一現象可用來解釋花椒籽黑種皮超微粉離散度較高的原因。通過對比3 種不同粒度的花椒籽黑種皮粉組織結構被破壞的程度，可以發現超微粉碎對花椒籽黑種皮組織和細胞壁的破壞程度較強。

2.4 不同粒度花椒籽黑種皮粉中紅外光譜分析

圖2 不同粒度花椒籽黑種皮粉的中紅外光譜Fig. 2 Infrared spectra of black seed coat powders of pepper with different particle sizes

花椒籽黑種皮粉的中紅外光譜如圖2所示，3 種不同粒度的粉體的峰的位置和形狀相差不大，表明超微粉碎并沒有改變花椒籽黑種皮主要成分的官能團結構，和文獻[29-31]研究結果一致。

花椒籽黑種皮基團的特征吸收峰主要集中在3 500～3 300、2 950～2 920、1 660～1 520、1 440～1 169 cm-1幾組峰上[32-33]。在1 600、1 500 cm-1左右的吸收是由于芳香環骨架振動引起的較強吸收峰；在2 923 cm-1處是烷烴的吸收峰；在3 404 cm-1處存在的較強共軛吸收峰，說明含有羥基（—OH）和氨基（—NH2）結構；在1 655 cm-1附近的較強吸收峰，說明分子中有羧基（—COOH）結構，與3 404 cm-1處的強吸收峰共同指示羧酸根（—COO-）的存在。花椒籽黑種皮粉的紅外圖譜中峰的大小變化可能是由于基團暴露或樣品顆粒大小不同引起散射強度變化的結果。

2.5 不同粒度花椒籽黑種皮粉色澤分析

表3 不同粒度花椒籽黑種皮粉的色澤Table 3 Color parameters of black seed coat powders of pepper with different particle sizes

色澤是粉體的重要感官指標，色澤的改善有利于提高其商業價值。由表3可知，與花椒籽黑種皮粗粉和細粉相比，超微粉的L*值明顯升高，表明超微粉碎可明顯增加花椒籽黑種皮的亮度；隨著粉體粒度的減小，a*值越來越大，表示花椒籽黑種皮超微粉偏紅色；相對于粗粉和細粉，花椒籽黑種皮超微粉的b*值顯著增加，表明超微粉碎處理后的花椒籽黑種皮粉偏黃色。粉體色澤的變化主要由于其粒徑的減小、混合均勻度的提高，同時比表面積的增大使得物料內部顯露出來所致[34]。

2.6 不同粒度花椒籽黑種皮粉持水力和持油力分析

表4 不同粒度花椒籽黑種皮粉的持水力和持油力Table 4 Water- and oil-holding capacity of black seed coat powders of pepper with different particle sizes

持水力和持油力是粉體親水和親脂性能的重要指標之一。由表4可知，花椒籽黑種皮粉的持水力和持油力隨著粉體粒度的減小而不斷增加，超微粉較粗粉持水力和持油力分別提高了33.33%和44.60%。可能是超微粉碎過程中的機械力增加了粉體顆粒的表面能，使空隙率增加，活性點增多，極大促進顆粒表面的基團與水分、油脂的結合；此外，粉體顆粒中的一些親水親脂基團暴露在外面，使水和油脂更容易與之結合[35]。

2.7 不同粒度花椒籽黑種皮粉吸附特性分析

圖3 不同粒度花椒籽黑種皮粉對Pb2＋的吸附量Fig. 3 The adsorpotion capacity of Pb2+ by black seed coat powder of pepper with different particle sizes

由圖3可知，隨著Pb2+質量濃度的增大，花椒籽黑種皮粉的吸附量逐漸增加，且相對于粗粉和細粉，花椒籽黑種皮超微粉的吸附量較高。這與Yang yang等[36]的研究結果一致，可能的原因是經超微粉碎后，粉體的均勻性更好，羧基、羥基等基團更充分地暴露出來，與金屬離子接觸也更充分，從而使花椒籽黑種皮粉對金屬離子的吸附能力增加。

2.8 不同粒度花椒籽黑種皮粉花椒籽黑種皮粉的多酚和黃酮含量及抗氧化活性

表5 不同粒度花椒籽黑種皮粉的多酚和黃酮含量及抗氧化活性Table 5 The contents of polyphenols and flavonoids and relative antioxidant activities of black seed coat powder of pepper with different particle sizes

由表5可知，花椒籽黑種皮超微粉中的多酚和黃酮含量均高于粗粉和細粉（P＜0.05），其多酚和黃酮含量分別為7.57 mg/g md和8.39 mg/g md。與花椒籽黑種皮粗粉相比，超微粉中多酚和黃酮的溶出量分別提高了15.93%和11.24%；且隨著粒徑的減小，花椒籽黑種皮超微粉對DPPH自由基和ABTS+·的清除能力均顯著提高（P＜0.05）。說明超微粉碎可以促進生物活性物質的溶出[37]。超微粉碎有助于植物類原料中有效成分溶出的主要機制體現在[38]：一方面超微粉碎能達到細胞級粉碎，物料顆粒細胞壁的破壞使得細胞內部成分溶出的阻力減小，從而提高有效成分的溶出率；同時，花椒籽黑種皮中的一些活性物質以結合態的形式存在，如與蛋白質等成分結合在一起，使得這類物質在檢測和提取過程中難以分離，從而造成損失。經過超微粉碎處理后，花椒籽黑種皮粉體中蛋白質等結構的改變、細化，促進了這部分結合態物質的釋放[39]；另一方面超微粉碎使花椒籽黑種皮粉碎后的顆粒微細化，有助于粉體顆粒的表面積和孔隙率增加，使其理化性能異于一般粉碎顆粒。因此，超微粉碎處理可以顯著提高花椒籽黑種皮活性物質的溶出。

3 結 論

花椒籽黑種皮經超微粉碎處理后平均粒徑降低至27.09 μm，色澤明顯提高，細胞壁破碎程度大，但官能團結構并沒有改變；與粗粉相比，花椒籽黑種皮超微粉的持水力和持油力分別提高了33.33%和44.60%，重金屬離子吸附性也顯著增強；花椒籽黑種皮粉體粒度的減小有利于多酚和黃酮的溶出，其溶出量分別提高了15.93%和11.24%，對DPPH自由基和ABTS+·清除能力顯著增強（P＜0.05）。因此，超微粉碎提高了花椒籽黑種皮粉的利用率，為花椒籽黑種皮產品的開發提供了依據。

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