貯藏及消化對藍莓酸奶中酚類物質穩定性及抗氧化活性影響

趙永波，杜玲玲，劉 璐，曲秀偉，王海霞，陳 萍，李曉東*

藍莓富含黃酮、花色苷等植物多酚，具有抵抗氧化應激、抗炎、抑菌及降低心血管疾病發病率等生物活性和生理功能[1-2]，營養和保健價值較高。隨著藍莓的研究與開發，藍莓酸奶等新型功能性乳制品受到消費者青睞，并成為補充日常膳食多酚的常見選擇。

食物中酚類物質的穩定性影響其抗氧化活性和吸收利用[3]。國內外文獻報道，藍莓多酚的穩定性與其種類及結構有關[4]，同時受pH值、溫度及食品添加劑等因素影響，例如花色苷在酸性條件下較為穩定，而高溫條件會導致其迅速降解，且VC能夠降低其熱穩定性[5]。另外，胃腸消化環境對多酚類物質的穩定性有不同程度影響，同時會改變其抗氧化活性，研究發現藍莓經模擬胃腸消化后其總酚、總黃酮含量及2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid，ABTS）自由基清除能力均高于消化前水平，而花色苷含量則變化不大[6]，也有報道稱藍莓的總酚、花色苷含量在模擬胃液消化時較為穩定，但在模擬腸液消化時分別降低了49%、15%[7]。在酸奶體系中，莓類多酚的不同添加工藝對酚類物質的穩定性有影響[8]，但在貯藏及消化時，酸奶中酚類物質的穩定性及抗氧化活性仍需進一步研究。

本實驗通過測定藍莓酸奶在4 ℃貯藏21 d及體外消化過程中總酚、總黃酮、花色苷含量及總抗氧化活力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和ABTS+·清除能力變化，并以藍莓果料、酸奶為對照，研究藍莓酸奶中多酚類物質的穩定性及抗氧化活性，為藍莓酸奶的健康功效和消費提供理論依據和建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

速凍藍莓由東北農業大學園藝學院提供，-20 ℃冷藏備用；脫脂乳粉 新西蘭紓祺公司；酸奶發酵劑北京川秀科技有限公司；變性淀粉（馬鈴薯羥丙基二淀粉磷酸酯） 天津頂峰淀粉開發有限公司；蔗糖、果膠（高甲氧基果膠）均為市售食品級；福林-酚試劑北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽、DPPH、ABTS 美國Sigma公司；沒食子酸（純度99%）、VC（純度99.7%） 天津市光復精細化工研究所；蘆丁（純度95%） 上海金穗生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

721紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；高速冷凍離心機 德國Sigma公司；高速組織剪切機 上海喬越電子有限責任公司；分析天平 賽多利斯儀器系統有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；數字式攪拌器 德國維根斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

藍莓果料的制備：參考?cibisz等[9]方法并略有改動。速凍藍莓（60%，質量分數，下同）、蔗糖（35%）、變性淀粉（2%）、果膠（0.6%）、水（2.4%），混勻并煮制10 min，灌裝于100 mL旋蓋玻璃瓶中，85 ℃、15 min殺菌，冷卻至室溫備用，最終藍莓果料的白利度（°Brix）為41.25。

酸奶的制備：取適量脫脂乳粉用溫水溶解，使得復原乳的總固形物含量為15 g/100 mL，均質（60 ℃、20 MPa），殺菌（85℃、15 min），冷卻至43 ℃并添加發酵劑（添加量為1 g/L），43.5 ℃恒溫發酵約4.5 h，至pH值低于4.7后終止發酵，冷卻至室溫后，取適量與藍莓果料混合，剩余部分作為酸奶對照備用。

藍莓酸奶的制備：藍莓果料在酸奶中的添加比例為20%。無菌條件下混勻并灌裝于上述滅菌玻璃瓶中。各樣品設3 組平行，4 ℃條件避光貯藏并確保貯藏條件一致。

貯藏期實驗：分別在1、5、10、15、21 d測定藍莓酸奶（2 g果料+8 g酸奶）、藍莓果料（2 g果料+8 g去離子水）及酸奶對照（8 g酸奶+2 g去離子水）的總酚、總黃酮、花色苷含量及總抗氧化活力、DPPH自由基和ABTS+·清除能力，并進行相關性分析。

體外消化實驗：在第3天分別對藍莓酸奶（2 g果料+8 g酸奶）、藍莓果料（2 g果料+8 g去離子水）及酸奶對照（8 g酸奶+2 g去離子水）進行體外消化處理，測定各樣品在消化前、模擬口腔、胃液及腸液消化后的多酚類物質含量和抗氧化活性。

1.3.2 各樣品提取液的制備

藍莓酸奶中多酚類物質的提取參考Cebeci等[10]方法并略有改動。取10 g藍莓酸奶置于50 mL離心管中，加15 mL酸化甲醇（含0.05 mL濃鹽酸），12 000 r/min剪切提取1 min，-20 ℃靜置1 h以使蛋白充分沉淀，4℃、7 000 r/min離心10 min，上清液用于多酚類物質含量和體外抗氧化活性測定。

2 g藍莓果料與8 g去離子水混勻作為藍莓果料的提取樣，8 g酸奶與2 g去離子水混勻作為酸奶對照的提取樣，其他處理同藍莓酸奶。

1.3.3 多酚類物質含量的測定

總酚含量的測定采用福林-酚法[11]，結果用沒食子酸當量表示（mg/100 g提取樣）；總黃酮含量的測定參考蔡萌等[12]方法，結果用蘆丁當量表示（mg/100 g提取樣）；花色苷含量的測定采用pH值示差法[13]，結果用矢車菊素-3-葡萄糖苷當量表示（mg/100 g提取樣）。

1.3.4 抗氧化活性的測定

總抗氧化活力的測定參考Berker等[14]方法，DPPH自由基清除能力的測定參考Shen Yingbin等[15]方法，ABTS+·清除能力的測定參考Re等[16]方法，均以VC（0.025～0.120 mg/mL）為標準品作標準曲線，結果用VC當量表示（mg/100 g提取樣）。

1.3.5 體外消化實驗

藍莓酸奶的體外消化實驗參考Oliveira等[17]方法。藍莓酸奶消化樣的質量為10 g，分別置于4 組50 mL離心管中，進行消化前、模擬口腔（1 min）、模擬胃液（1 h）和模擬腸液（2 h）消化；2 g藍莓果料與8 g去離子水混勻作為藍莓果料的消化樣，8 g酸奶與2 g去離子水混勻作為酸奶對照的消化樣，其他處理同藍莓酸奶。各樣品消化前后的提取和測定按照1.3.2～1.3.4節方法執行。

1.4 數據處理

各實驗重復3 次，結果用 ±s表示，用SigmaPlot 12.5軟件作圖，用SPSS 20.0統計軟件分析數據的差異顯著性（P＜0.05表示差異顯著）和相關性。

2 結果與分析

2.1 貯藏期各樣品多酚類物質含量變化

圖1 貯藏期各樣品的總酚（A）、總黃酮（B）和花色苷（C）含量變化Fig. 1 Changes in the contents of total phenolics (A), total flavonoids (B)and anthocyanins (C) in different samples during storage

由圖1A可知，藍莓酸奶的總酚含量在1～10 d呈下降趨勢（P＜0.05），從46.14 mg/100 g提取樣降至40.24 mg/100 g提取樣，10～21 d無明顯變化，到21 d結束時較第1天降低了10.20%；藍莓果料、酸奶對照的總酚含量均在第5天達到最大值（63.72、8.50 mg/100 g提取樣），到21 d結束時，前者較第1天降低了1.93%，后者則提高了5.80%。

由圖1B可以看出，貯藏初期，藍莓酸奶的總黃酮含量為41.63 mg/100 g提取樣，1～5 d無顯著變化（P＞0.05），5～10 d顯著降低（P＜0.05），后期保持相對穩定，整個貯藏期降幅為9.86%；藍莓果料的總黃酮含量在第5天最高（50.33 mg/100 g提取樣），5～15 d顯著降低（P＜0.05），貯藏期結束時較第1天降低了3.46%；酸奶對照的總黃酮含量略有降低，從10.35 mg/100 g提取樣降為8.34 mg/100 g提取樣。

從圖1C可明顯看出，藍莓酸奶的花色苷含量在貯藏期間顯著降低，1～5 d從9.01 mg/100 g提取樣降至8.37 mg/100 g提取樣（P＜0.05），中期雖有所回升，但后期又不斷下降，整個貯藏期降幅為15.54%（P＜0.05），而藍莓果料的花色苷含量在貯藏期間無顯著變化（P＞0.05），貯藏末期較第1天僅降低了0.03%；酸奶對照中無花色苷檢出。

結合圖1可以得出，藍莓酸奶的總酚、總黃酮和花色苷含量均低于藍莓果料，降幅均高于藍莓果料。研究表明，藍莓果料與酸奶混合后，酸奶中與多酚類物質親和力較高的β-乳球蛋白[18]以及α-、β-、κ-酪蛋白[19]與藍莓多

酚化合物發生絡合反應，生成大量蛋白-多酚絡合物并發生聚沉，多酚化合物的提取率降低，可提取的游離態多酚類物質含量低于藍莓果料；貯藏期間，藍莓酸奶中各酚類物質含量降幅大于藍莓果料，表明酸奶體系降低了多酚類物質的貯藏穩定性，一方面可能是藍莓酸奶中相對較高的pH值環境（藍莓酸奶的pH 4.05～4.01，藍莓果料pH 3.04～3.02）對酚類物質的穩定性不利；另一方面乳酸菌的分解代謝作用也加劇了多酚類物質的降解和轉化[8-9]。另外，酸奶對照中檢測到總酚、總黃酮，但含量較低，有報道稱這可能是酸奶中可溶性蛋白組分影響檢測方法的結果[10,20]。

2.2 貯藏期各樣品抗氧化活性變化

圖2 貯藏期各樣品的總抗氧化活力（A）、DPPH自由基（B）和ABTS＋ ·清除能力（C）變化Fig. 2 Changes in total antioxidant capacity (A), DPPH (B) and ABTS (C)radical scavenging activity of different samples during storage

由圖2A可知，藍莓酸奶的總抗氧化活力在1～10 d呈降低趨勢，從44.51 mg/100 g提取樣降至42.06 mg/100 g提取樣，10～21 d無顯著變化（P＞0.05），整個貯藏期降幅為6.52%；藍莓果料的總抗氧化活力在第5天達到最大值（62.42 mg/100 g提取樣），貯藏期結束時較第1天降低了3.58%；酸奶對照的總抗氧化活力在貯藏期間保持穩定。

由圖2B可知，藍莓酸奶的DPPH自由基清除能力在1～5 d顯著降低，從59.49 mg/100 g提取樣降至56.76 mg/100 g提取樣（P＜0.05），5～21 d無顯著變化（P＞0.05），貯藏期降幅為6.22%；藍莓果料的DPPH自由基清除能力在第5天達到最大值（88.43 mg/100 g提取樣），到21 d結束時較初期降低了4.17%；酸奶對照的DPPH自由基清除能力在第10天達到最大值（9.65 mg/100 g提取樣），貯藏末期降為5.62 mg/100 g提取樣。

由圖2C可知，藍莓酸奶的ABTS+·清除能力在1～10 d有所降低，從61.39 mg/100 g提取樣降至58.30 mg/100 g提取樣，10～21 d無顯著變化（P＞0.05），貯藏期降幅為4.91%；藍莓果料的ABTS+·清除能力在第5天達到最大值（95.36 mg/100 g提取樣），貯藏期結束時較初期降幅為1.29%；酸奶對照的ABTS+·清除能力在第10天最高（7.57 mg/100 g提取樣），貯藏末期降至5.67 mg/100 g提取樣。

結合圖1、2可知，藍莓酸奶中各抗氧化指標與其多酚類物質含量變化情況相似，可能是藍莓酸奶的抗氧化活性主要受多酚類物質含量影響。在藍莓酸奶體系中，多酚-蛋白發生共價和非共價結合并產生沉淀，使得能夠參與自由基清除反應的游離態多酚含量降低[21]，從而導致其對DPPH自由基及ABTS+·的清除能力降低；也有研究稱乳蛋白的交聯作用阻礙其酚環上羥基等活性基團的供電子能力[22]，總抗氧化活性隨之降低。另外，3 種抗氧化指標中均檢測到酸奶對照具有一定的抗氧化活性，這是由于酸奶在發酵及貯藏期間水解生成部分抗氧化肽以及具有抗氧化活性的游離氨基酸等成分造成的[23]。

2.3 相關性分析

各樣品的總酚、總黃酮和花色苷含量及總抗氧化活力、DPPH自由基和ABTS+·清除能力的相關系數（R）如表1所示，藍莓酸奶的總酚、總黃酮含量與各抗氧化指標均呈顯著正相關（P＜0.05）；藍莓果料的總酚含量與總抗氧化活力呈極顯著正相關（P＜0.01），與其他抗氧化指標呈顯著正相關（P＜0.05），總黃酮含量與DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關（P＜0.01），與其他抗氧化指標呈顯著正相關（P＜0.05），表明藍莓酸奶、藍莓果料中總酚、總黃酮含量與其抗氧化活性之間密切相關。

表1 多酚類物質含量與抗氧化活性的相關性分析Table 1 Correlation analysis between polyphenol content and antioxidant activity of different samples

2.4 體外消化前后各樣品多酚類物質含量變化

圖3 各樣品體外消化前后總酚（A）、總黃酮（B）和花色苷（C）含量變化Fig. 3 Changes in the contents of total phenolics (A), total flavonoids (B) and anthocyanins (C) in different samples during simulated gastrointestinal digestion

由圖3A可知，消化前藍莓酸奶、藍莓果料、酸奶對照的總酚含量分別為45.63、62.67、6.04 mg/100 g提取樣；模擬口腔消化1 min后，總酚含量均無顯著變化（P＞0.05），表明口腔消化對多酚類物質影響不大；模擬胃液消化1 h后，各樣品的總酚含量較消化前分別提高了199.56%、12.28%、1 708.33%（P＜0.05），表明模擬胃液消化能夠促進各樣品酚類物質的釋放，可能是在胃蛋白酶和胃酸作用下，有利于酚類物質從蛋白、果膠等的交聯作用中釋放[7,24]，并從結合態轉化為游離態；同時，藍莓酸奶、酸奶對照的總酚含量均高于藍莓果料，這可能是乳蛋白被胃蛋白酶水解后生成大量水溶性蛋白[25]，導致其總酚測定結果大大提高；模擬腸液消化2 h后，藍莓酸奶、酸奶對照的總酚含量較消化前分別提高了198.03%、1 961.67%，而藍莓果料的總酚含量卻較消化前降低了3.35%（P＜0.05），表明藍莓多酚在模擬腸液消化時部分發生降解，而藍莓酸奶中的乳蛋白在胰蛋白酶作用下進一步水解并釋放水溶性蛋白，掩蓋了藍莓多酚的損失，總酚含量仍保持較高水平。

由圖3B可知，消化前，藍莓酸奶、藍莓果料、酸奶對照的總黃酮含量分別為41.10、48.48、12.78 mg/100 g提取樣；模擬胃液消化1 h后，藍莓酸奶、藍莓果料、酸奶對照的總黃酮含量較消化前分別提高了66.18%、8.45%、31.25%（P＜0.05），表明模擬胃液消化能夠促進黃酮物質的釋放；模擬腸液消化2 h后，藍莓果料的總黃酮含量達到最大值（58.79 mg/100 g提取樣），一方面可能是胰蛋白酶、膽鹽等作用有利于黃酮類物質從果料基質中游離釋放；另一方面也可能是非黃酮類物質在腸液pH值環境中轉化為黃酮類物質[17]；但藍莓酸奶的總黃酮含量（51.86 mg/100 g提取樣）卻低于藍莓果料，可能是酸奶基質阻礙了藍莓黃酮的釋放，相同報道稱藍莓與牛奶共同消化會降低藍莓黃酮的生物利用率[26]。

由圖3C可知，消化前，藍莓酸奶、藍莓果料的花色苷含量分別為8.57、9.96 mg/100 g提取樣；模擬胃液消化1 h后，藍莓酸奶的花色苷含量較消化前提高了16.22%（P＜0.05），藍莓果料則較消化前無顯著變化（P＞0.05）；模擬腸液消化2 h后，藍莓酸奶、藍莓果料的花色苷含量（6.62、4.40 mg/100 g提取樣）均顯著降低（P＜0.05），甚至低于消化前水平，表明花色苷在腸液消化環境下發生了降解，但藍莓酸奶的花色苷含量大于藍莓酸奶，可能是酸奶對花色苷有保護作用。McDougall等[27]同樣報道樹莓與面包、冰淇淋等結合能夠提高其花色苷等不穩定多酚類物質的小腸消化耐受性。

2.5 體外消化前后各樣品抗氧化活性變化

圖4 各樣品體外消化前后總抗氧化活力（A）、DPPH自由基（B）和ABTS＋ ·清除能力（C）變化Fig. 4 Changes in total antioxidant capacity (A), DPPH (B) and ABTS (C) radical scavenging activity of different samples during simulated gastrointestinal digestion

由圖4A可知，消化前，藍莓酸奶、藍莓果料、酸奶對照的總抗氧化活力分別為43.48、60.57、26.89 mg/100 g提取樣；模擬口腔消化1 min后，各樣品的總抗氧化活力較消化前均無顯著變化（P＞0.05）；模擬胃液消化1 h后，各樣品的總抗氧化活力較消化前分別提高了100.92%、15.35%、107.43%（P＜0.05）；模擬腸液消化2 h后，各樣品的總抗氧化活力較胃液消化有所下降，但較消化前仍分別提高了79.31%、6.27%、98.51%（P＜0.05）。

由圖4B可知，消化前，藍莓酸奶、藍莓果料、酸奶對照的DPPH自由基清除能力分別為61.25、86.38、6.35 mg/100 g提取樣；模擬胃液消化1 h后，各樣品的DPPH自由基清除能力較消化前分別提高了32.63%、7.18%、209.38%（P＜0.05）；模擬腸液消化2 h后，藍莓酸奶、藍莓果料的DPPH自由基清除能力較胃液消化無明顯變化（P＞0.05），而酸奶對照的DPPH自由基清除能力無檢出，可能是酸奶對照中抗氧化物質的DPPH自由基清除活性受pH值影響。

由圖4C可知，消化前，藍莓酸奶、藍莓果料、酸奶對照的ABTS+·清除能力分別為60.61、93.46、6.62 mg/100 g提取樣；模擬胃液消化1 h后，各樣品的ABTS+·清除能力較消化前分別提高了69.47%、11.44%、274.24%（P＜0.05）；模擬腸液消化2 h后，各樣品的ABTS+·清除能力較胃液消化均顯著下降（P＜0.05），但對比消化前水平，藍莓酸奶、酸奶對照的ABTS+·清除能力分別提高了52.15%、222.73%，而藍莓果料則降低了10.16%。

結合圖3、4可知，各樣品的抗氧化活性物質主要在胃消化階段釋放，抗氧化活性隨之提高，但不同抗氧化指標對藍莓酸奶、藍莓果料的抗氧化活性大小評價結果不同，可能是由于經模擬胃液消化后，藍莓酸奶中除酚類物質外，伴隨釋放的可溶性蛋白、半纖維素、游離氨基酸、抗氧化肽、活性多糖等[17]也在同時發揮抗氧化作用，不同抗氧化物對鐵離子還原力或不同人造自由基的清除能力各異，且不同抗氧化成分間還可能存在抗氧化相互作用[28]，造成評價結果有差異。模擬腸液消化后，藍莓酸奶的總抗氧化活力和ABTS+·清除能力均大于藍莓果料，但由于酸奶對照喪失其DPPH自由基清除能力，造成藍莓酸奶對DPPH自由基的清除能力低于藍莓果料。

3 結 論

貯藏期間，藍莓酸奶的總酚、總黃酮、花色苷含量及總抗氧化活力、DPPH自由基和ABTS+·清除能力降幅均高于藍莓果料，表明酸奶體系降低了多酚類物質的穩定性和抗氧化活性。消化前，藍莓酸奶的各指標水平均低于藍莓果料，經模擬胃腸消化后，藍莓酸奶中除花色苷外其他各指標水平較消化前均顯著提高（P＜0.05），且總酚、花色苷、總抗氧化活力、ABTS+·清除能力均高于藍莓果料，說明藍莓酸奶經胃腸消化后其多酚類物質被釋放，抗氧化活性得到增強。

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