不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中嫩度的影響

孔令明，李 芳，張 文，達迪拉·買買提，楊海燕,*

馬肉具有很高的營養價值，其瘦肉多、脂肪含量少，且脂肪中多不飽和脂肪酸含量高達61.0%～65.5%，膽固醇含量遠低于牛、羊、豬肉。馬肉的蛋白質含量也較高，一般為20.0%～24.0%，比豬肉和羊肉高，且含有20多種氨基酸，其中以賴氨酸最為豐富。馬肉中還含有許多人體所需的維生素和礦物質，其中鐵含量是豬肉的5～6 倍，牛、羊肉的8～9 倍，可以作為優質的補血食品[1]。近年來，人們越來越青睞于營養價值高的馬肉，在日本、法國、德國、意大利等很多國家，馬肉己成為深受歡迎的肉食品之一，故馬肉在國際市場的需求量猛漲。我國有著豐富而優質的馬肉資源，新疆是我國馬匹的主要產區，熏馬腸、熏馬肉等傳統馬肉制品是新疆各族人民非常喜愛的具有民族特色的肉食品。

嫩度是肉的主要食用品質之一，也是消費者在評判肉品質好壞時最常用的評價指標之一。馬肉存在肉質較為粗糙、嫩度較差的問題，這與馬的品種、性別、年齡、飼養方式、宰后肉成熟時間、溫度、結締組織、肌原纖維和肌漿的含量及化學結構狀態等多種因素有關。因此，為提高馬肉的食用品質，適應現代消費者對肉品質鮮嫩、口感良好、嫩度適口的需求，采取有效的嫩化方法來改善馬肉嫩度已成為必然。

目前，國內外關于改善馬肉嫩度方面的研究報道很少。國內主要是針對馬肉嫩度的測定、貯藏溫度對馬肉嫩度的影響以及采用蛋白酶處理對馬肉進行嫩化等方面進行報道。巴吐爾·阿不力克木等[2]研究了不同貯藏溫度對馬肉不同部位嫩度變化的影響，結果表明，在15、4、-18 ℃下馬肉的臀肌、肩肌和背最長肌的剪切力與蒸煮損失率呈負相關，與脂肪含量、系水力呈正相關；秦菊等[3]對伊犁地區馬肉嫩度進行了測定和分析；蔣小鋒等[4]對蛋白酶結合滾揉處理對馬肉嫩度的影響進行了研究。國外主要為馬肉保鮮過程中微生物組分及品質變化方面的研究報道[5-6]，有關電刺激處理促進馬肉嫩度方面的理論研究尚鮮見報道。

國內外已有研究表明，對牛、羊胴體進行電刺激處理可以改善肉的嫩度：Hwang等[7]研究發現，電刺激處理可以加快牛肉糖酵解速度，降低pH值，防止冷收縮，使肌纖維結構斷裂，加快肌肉組織的溶解，進而提高肉的嫩度；Toohey等[8]研究發現電刺激處理提高了羊肉的肌原纖維小片化指數（myofibrillar fraglllentation index，MFI），降低了剪切力，改善了肉的嫩度；Ferguson等[9]指出電刺激處理可以縮短牛肉成熟的時間，加快肉嫩化的過程；Pophiwa等[10]研究發現電刺激處理提高了山羊肉的嫩度；羅欣等[11]研究發現對宰后牛胴體進行電刺激處理可有效改善肉的嫩度；張睿等[12]研究發現電刺激處理明顯降低了成熟過程中熱剔骨牦牛西冷的剪切力，改善了肉的嫩度；郎玉苗等[13]研究發現電刺激處理與成熟結合可顯著提高冷熱剔骨牦牛肉的嫩度。

本研究以新疆馬肉為原料，采用電刺激處理馬肉，研究了不同電刺激處理時間在成熟過程中對馬肉嫩度的影響，為馬肉資源的品質改善、開發利用及產業化發展提供可靠的理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬肉：隨機選取來自新疆伊犁州昭蘇縣草原牧馬場自然放牧飼養、健康無病的伊犁公馬18 匹（36～60 月齡，體質量（300±50） kg）。

異丙醇、對二氨基苯甲醛、高氯酸、碘乙酸、鹽酸、乙醇、叔丁醇等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

STIM E512電刺激儀 德國FREUND公司；TDL-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫療儀器有限公司；數顯溫度計 美國Delta TRAK公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；Tu-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TA.XT2i型物性儀 英國Stable Micro Systems公司；SU8010掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；FSH-2型可調高速勻漿機金壇市城東新瑞儀器廠；DZ-260P臺式真空包裝機上海青葩食品包裝機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組

電刺激處理組：馬匹隨機分成6 組，每組3 匹，選取其中一組作為對照組按正常流程屠宰，其余5 組正常宰殺放血后用電刺激儀進行電刺激處理（電壓42 V、頻率50 Hz、電流0.7 A），各組電刺激處理時間分別為20、40、60、80、100 s，待6 組馬匹分割后取背最長肌，真空包裝后置于0～4 ℃環境下成熟，分別在成熟1、3、7、14 d時取樣，測定蒸煮損失率、剪切力、可溶性蛋白濃度（soluble protein concentration，SPC）、MFI、膠原蛋白溶解性，并且在掃描電子顯微鏡下觀察肌原纖維的超顯微結構。

1.3.2 蒸煮損失率的測定

稱取馬肉100 g，剔除可見結締組織和脂肪，切分成小塊，用蒸煮袋包裝后，于80 ℃水浴中恒溫加熱至馬肉的中心溫度達到70 ℃，取出肉樣冷卻至常溫，用濾紙拭干表面水分后稱其質量。按下式計算蒸煮損失率。

1.3.3 剪切力的測定

將解凍好的肉樣用濾紙拭干表面水分，沿著肌纖維方向切取1 cm×1 cm×5 cm的肉條，用TA.XT2i型物性儀測定其剪切力，每個處理組分別測定3 個肉樣，取其平均值。剪切力測定參數為：探頭HDP/BSW；測試模式TPA；測試前速率2.00 mm/s；測試速率2.00 mm/s；測試后速率10.00 mm/s；下壓距離30.00 mm；負載類型Auto-20 g；數據獲得率500 pps。

1.3.4 SPC和MFI的測定

SPC采用雙縮脲法測定，牛血清白蛋白作為標準蛋白。MFI的測定按照Culler等[14]的方法。取4 g馬肉，加入40 mL 4 ℃的MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3），勻漿后，于離心機中10 000 r/min離心2 min，倒出上清液，用于測定SPC。沉淀繼續在40 mL MFI緩沖溶液中攪拌成懸液，于10 000 r/min離心2 min，倒出上清液，沉淀在10 mL MFI緩沖溶液中制成懸液，用銅制篩網（40 目）過濾。然后用MFI緩沖液將濾液的蛋白質量濃度調整為0.5 mg/mL，于540 nm波長處測吸光度，將吸光度乘200即得到MFI。

1.3.5 膠原蛋白溶解性分析

采用Ringer’s試劑溶解法，參考Hill[15]和Bergman[16]等的方法，通過測定可溶性膠原蛋白含量與總膠原蛋白含量計算膠原蛋白的溶解性。

1.3.6 肌原纖維超微結構觀察

樣品制備參照Nishimura等[17]的方法并略作修改。將所制備好的肉樣切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊，于4 ℃下在戊二醛中固定72 h，然后用磷酸鹽緩沖液分別清洗3 次，每次30 min，依次用體積分數50%、70%、80%、90%的乙醇溶液梯度脫水，各浸泡15 min，再用無水乙醇反復脫水3 次，每次30 min，脫水后用叔丁醇置換3 次，每次30 min。將置換后的樣品切片，冷凍干燥，用離子濺射儀在樣品表面鍍一層金屬膜，于掃描電子顯微鏡下觀察肌原纖維的微觀結構。

1.4 數據分析處理

用Minitab 16.0軟件處理實驗數據，用Tukey法進行顯著性分析，用Excel 2003軟件制作圖形。以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中蒸煮損失率的影響

蒸煮損失率是評價肌肉保水性的重要指標之一。由圖1可以看出，不同電刺激處理時間組馬肉的蒸煮損失率差異不顯著（P＞0.05），隨著電刺激處理時間的延長，各處理組之間變化規律不明顯，說明不同的電刺激處理時間均未對馬肉的蒸煮損失率產生明顯影響。郎玉苗等[13]研究發現，電刺激處理對牦牛背最長肌的蒸煮損失率沒有顯著影響，這與本實驗的結果相一致。這可能是因為肌纖維膜需要較長時間才會失去保持水分的功能，因此電刺激處理對肌肉持水力沒有明顯影響[18]。而隨著成熟時間的延長，不同處理組馬肉的蒸煮損失率均呈現下降趨勢。這可能是因為肉在成熟過程中尸僵漸漸消失，肌肉系水力回升使蒸煮損失率下降[11]。

圖1 不同電刺激時間處理后馬肉蒸煮損失率在成熟過程中的變化Fig. 1 Variation in cooking loss of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

2.2 不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中剪切力的影響

圖2 不同電刺激時間處理后馬肉剪切力在成熟過程中的變化Fig. 2 Variation in shear force of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

剪切力是評價肉嫩度最常用的指標之一。由圖2可知，在電刺激0、20、40、60 s時，成熟1、3、7 d后，隨著電刺激處理時間的延長，馬肉的剪切力呈逐漸下降趨勢，不同處理組之間馬肉的剪切力差異顯著（P＜0.05）。且同一電刺激時間處理后，隨成熟時間的延長，馬肉的剪切力呈明顯下降趨勢。當成熟時間為14 d時，不同電刺激時間處理組馬肉的剪切力變化不明顯。

電刺激60 s時，成熟1 d和14 d后馬肉的剪切力分別較對照組下降了15.5%和13.8%，成熟14 d時馬肉的剪切力較成熟1 d時下降了47.5%。國內外研究表明，電刺激處理加快了宰后肉的糖酵解速率及肌原纖維與骨架蛋白的降解速度，同時破壞了肌纖維結構，從而提高了嫩度[19-22]。但在電刺激60 s后，繼續延長電刺激處理時間，馬肉剪切力未繼續呈現下降趨勢，且電刺激處理100 s時，剪切力略有上升。適度的電刺激處理可以減小馬肉成熟過程中的剪切力，但較長時間的電刺激處理可能導致肉發生熱收縮[23]，從而使剪切力有增大的趨勢。

2.3 不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中SPC的影響

圖3 不同電刺激時間處理后馬肉SPC在成熟過程中的變化Fig. 3 Variation in SPC of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

如圖3所示，在電刺激處理0、20、40、60 s時，隨著電刺激處理時間的延長，各處理組馬肉的SPC呈上升趨勢。電刺激處理20、40、60、80 s和100 s后，成熟14 d的馬肉的SPC分別是對照組的1.05、1.07、1.16、1.17、1.17 倍。同時根據數據分析可知，電刺激處理時間為20、40 s處理組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05），而60、80、100 s處理組的馬肉的SPC均顯著高于前3 個處理組（P＜0.05），說明雖然不同電刺激處理時間均促進了馬肉SPC的上升，但電刺激處理達到一定時間才會顯著增強馬肉的嫩化效果。在電刺激60 s后，隨著電刺激處理時間的延長，馬肉的SPC的變化趨于平緩。電刺激處理加快了糖酵解的反應速度，使pH值快速下降，鈣激活酶的活性提高，肌原纖維蛋白及肌質網遭到破壞，肌細胞間鈣離子的濃度升高，肌纖維降解速度加快，從而可能引起SPC的升高[24]。

2.4 不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中MFI的影響

圖4 不同電刺激時間處理后馬肉MFI在成熟過程中的變化Fig. 4 Variation in MFI of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

肌肉成熟過程中，肌原纖維從Z線斷裂從而導致肌原纖維小片化，MFI是評價肉嫩度的一個非常重要的指標[25-27]，它反應了肌細胞內部肌原纖維及骨架蛋白的完整性。由圖4可知，在電刺激0、20、40、60 s時，隨著電刺激處理時間的延長，馬肉的MFI呈上升趨勢，差異顯著（P＜0.05）。同時還可看出，隨成熟時間的延長，各處理組及對照組馬肉的MFI呈顯著上升趨勢，通過分析發現，不同成熟時間馬肉的MFI存在極顯著差異（P＜0.01）。電刺激60 s、成熟14 d時馬肉的MFI是對照組的1.28 倍。由此可知，電刺激處理會使馬肉成熟過程中的MFI顯著上升。這可能是由于電刺激處理破壞了肌質網，加速了馬肉肌原纖維蛋白的降解，從而引起MFI的升高[24]。

2.5 不同電刺激處理時間對宰后馬肉成熟過程中膠原蛋白溶解性的影響

圖5 不同電刺激時間處理后馬肉膠原蛋白溶解性在成熟過程中的變化Fig. 5 Variation in collagen solubility of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

膠原蛋白溶解性反映了肉中可溶性膠原蛋白在總膠原蛋白中的含量高低，是體現由膠原蛋白構成的“背景嫩度”的重要指標[28]。對圖5分析可知，電刺激處理時間在0～100 s范圍內，隨電刺激處理時間的延長，在成熟1 d和3 d時各處理組馬肉的膠原蛋白溶解性間均不存在顯著差異（P＞0.05）。在成熟7 d和14 d時，0 s與20 s處理組間不存在顯著差異（P＞0.05）。而20 s與40、60、80、100 s處理組間均存在極顯著差異（P＜0.01），說明在電刺激處理時間達到40 s以后，電刺激處理對馬肉的膠原蛋白溶解性有顯著影響。當電刺激40 s、成熟7、14 d時，馬肉膠原蛋白溶解性分別達到對照組7 d和14 d時的1.36 倍和1.34 倍。同時，同一電刺激時間處理后，隨成熟時間的延長，馬肉的膠原蛋白溶解性呈顯著上升趨勢，分析表明，同一處理組的不同成熟時間之間，馬肉膠原蛋白溶解性存在極顯著差異（P＜0.01）。研究結果表明，電刺激處理可以降低膠原蛋白之間的交聯度，進而提高可溶性膠原蛋白的含量，改善馬肉的嫩度。

2.6 電刺激處理對宰后馬肉成熟過程中超微結構的影響

圖6 電刺激處理后馬肉微觀結構在成熟過程中的變化Fig. 6 Variation in microstructure of horsemeat with different electrical stimulation durations during aging

電刺激處理對肌原纖維造成了物理性破壞，產生大量的攣縮帶和拉伸帶，有利于提高肉的嫩度[29]。如圖6所示，與對照組相比，經電刺激處理的宰后馬肉在成熟過程中，肌束排列規則性更明顯地發生了變化，同時肌纖維也發生了較明顯的斷裂。隨著馬肉的不斷成熟，不規則排列越來越明顯，肌纖維的斷裂也更多。電刺激處理后的馬肉，在成熟7 d和14 d時，肌纖維的小片化現象更加明顯。由此可見，電刺激處理改變了馬肉肌纖維排列結構，對肌纖維結構也造成了破壞。這與研究結果中電刺激處理使MFI上升相符。George等[18]研究發現，電刺激處理使牛肉肌漿網過量釋放鈣離子，從而產生攣縮帶，破壞了肌纖維結構，使嫩度得到改善。

3 結 論

電刺激處理對馬肉背最長肌的蒸煮損失率沒有產生顯著影響，但對馬肉的剪切力、SPC、MFI和膠原蛋白溶解性都有明顯影響。在一定電刺激處理時間范圍內，由于電刺激處理加快了宰后馬肉的糖酵解速率及肌原纖維與骨架蛋白的降解速度，降低了膠原蛋白之間的交聯度，從而使馬肉剪切力下降，SPC上升，MFI上升，膠原蛋白溶解性上升。電刺激60 s對馬肉的嫩度提升具有較好的效果，進一步延長電刺激處理時間效果提升不明顯。綜上所述，適當的電刺激處理能夠促進宰后馬肉的成熟，使較為粗糙的馬肉得到有效嫩化，且該方法便于操作，在馬肉加工產業化方面具有廣闊的市場前景。

參考文獻：

[1] 王利, 錢澤濤. 馬肉的生產加工現狀及其發展趨勢[J]. 肉類研究,2008, 22(9): 66-68.

[2] 巴吐爾·阿不力克木, 趙立男, 申萍. 貯藏溫度對馬肉不同部位嫩度變化的影響[J]. 食品工業科技, 2015, 36(4): 339-343.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.065.

[3] 秦菊, 楊東樹, 張曉紅, 等. 伊犁地區馬肉嫩度的測定與分析[J]. 新疆農業科學, 2014, 51(3): 577-582.

[4] 蔣小鋒, 李芳, 任雯雯, 等. 木瓜蛋白酶結合滾揉處理對馬肉嫩度的影響[J]. 食品與發酵工業, 2014, 40(12): 230-234. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201412043.

[5] BONILAURI P, LIUZZO G, MERIALDI G, et al. Growth of Listeria monocytogenes on vacuum-packaged horsemeat for human consumption[J]. Meat Science, 2004, 68(4): 671-674. DOI:10.1016/j.meatsci.2004.05.014.

[6] IRENA S, JACEK K. Effect of horsemeat enrichment on autolytic changes in intramuscular lipids during cold storage[J]. Microbial Drug Resistance, 2000, 12(3): 164-168.

[7] HWANG I H, DEVINE C E, HOPKINS D L. The biochemical and physical effects of electrical stimulation on beef and sheep meat tenderness[J]. Meat Science, 2003, 65: 677-691. DOI:10.1016/S0309-1740(02)00271-1.

[8] TOOHEY E S, HOPKINS D L, STANLEY D F, et al. The impact of new generation pre-dressing medium-voltage electrical stimulation on tenderness and colour stability in lamb meat[J]. Meat Science, 2008,79(4): 683-691. DOI:10.1016/j.meatsci.2007.10.036.

[9] FERGUSON D M, JIANG S T, HEARNSHAW H, et al. Effect of electrical stimulation on protease activity and tenderness of M. longissimus from cattle with different proportions of Bos indicus content[J]. Meat Science, 2000, 55: 265-272. DOI:10.1016/S0309-1740(99)00131-X.

[10] POPHIWA P, WEBB E C, FRYLINCK L. Meat quality characteristics of two South African goat breeds after applying electrical stimulation or delayed chilling of carcasses[J]. Small Ruminant Research, 2016,145: 107-114. DOI:10.1016/j.smallrumres.2016.10.026.

[11] 羅欣, 周光宏. 電刺激和延遲冷卻對牛肉食用品質的影響[J]. 中國農業科學, 2008, 41(1): 188-194.

[12] 張睿, 羅欣, 朱立賢, 等. 超低壓電刺激和熱剔骨工藝對牦牛肉品品質的影響[J]. 食品與發酵工業, 2014, 40(10): 213-218.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2014.10.076.

[13] 郎玉苗, 張睿, 謝鵬, 等. 電刺激和成熟對冷熱剔骨牦牛肉品質的影響[J]. 中國食品學報, 2017, 17(3): 177-185. DOI:10.16429/j.1009-7848.2017.03.022.

[14] CULLER R D, PARRISH F C, SMITH G C. Relationship of myofibril fragmentation index to certain chemical, physical and sensory characteristics of bovine longissimus muscle[J]. Journal of Food Science, 1978, 43(4): 1177-1180. DOI:10.1111/j.1365-2621.1978.tb15263.x.

[15] HILL F. The solubility of intramuscular collagen in meat animals of various ages[J]. Food Science, 1966, 31(2): 161-166. DOI:10.1111/j.1365-2621.1966.tb00472.x.

[16] BERGMAN I, LOXLEY R. Two improved and simplified methods for the spectrophotometric determination of hydroxyproline[J]. Analytical Chemistry, 1963, 35: 1961-1965. DOI:10.1021/ac60205a053.

[17] NISHIMURA T, HATTORI A, TAKAHASHI K. Structural changes in intramuscular connective tissue during the fattening of Japanese black cattle, effect of marbling on beef tenderization[J]. Journal of Animal Science, 1999, 77(1): 93-104. DOI:10.2527/1999.77193x.

[18] GEORGE A R, BENDALL J R, JONES R C D. The tenderising effect of electrical stimulation of beef carcasses[J]. Meat Science, 1980, 4(1):51-68. DOI:10.1016/0309-1740(80)90023-6.

[19] HOPE-JONES M, STRYDOM P E, FRYLINCK L, et al. The efficiency of electrical stimulation to counteract the negative effects of β-agonists on meat tenderness of feedlot cattle[J]. Meat Science, 2010,86(3): 699-705. DOI:10.1016/j.meatsci.2010.06.008.

[20] ROSENVOLD K, NORTH M, DEVINE C, et al. The protective effect of electrical stimulation and wrapping on beef tenderness at high pre rigor temperatures[J]. Meat Science, 2008, 79(2): 299-306.DOI:10.1016/j.meatsci.2007.10.002.

[21] GURSANSKY B, O’HALLORAN J M, EGAN A, et al. Tenderness enhancement of beef from Bos indicus and Bos taurus cattle following electrical stimulation[J]. Meat Science, 2010, 86(3): 635-641.DOI:10.1016/j.meatsci.2010.05.002.

[22] 王莉, 王玉濤, 郭麗君, 等. 電刺激對宰后牦牛肉成熟過程中肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白及嫩度的影響[J]. 食品工業科技, 2017, 38(11):65-70; 75. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.004.

[23] 田園, 黨欣, 韓玲, 等. 不同電刺激時間對牦牛肉在成熟過程中品質變化的影響[J]. 食品工業科技, 2014, 35(1): 56-60; 65.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.01.053.

[24] 田園, 孫志昶, 余群力, 等. 低壓電刺激對牦牛肉宰后成熟過程中嫩度及肌纖維超微結構的影響[J]. 食品科學, 2014, 35(7): 43-47.

[25] 賈青, 余群力, 田園, 等. 低壓電刺激對不同部位宰后牦牛肉肌原纖維蛋白水解的影響[J]. 食品工業科技, 2015, 36(5): 53-57.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.002.

[26] CONTRERAS-CASTILLO C J, LOMIWES D, WU G, et al. The effect of electrical stimulation on post mortem myofibrillar protein degradation and small heat shock protein kinetics in bull beef[J]. Meat Science, 2016, 113: 65-72. DOI:10.1016/j.meatsci.2015.11.012.

[27] 鄭祖林, 韓玲, 余群力, 等. 電刺激對白牦牛不同部位肉品質及感官特性的影響[J]. 食品工業科技, 2014, 35(2): 131-135. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.02.080.

[28] 常海軍. 不同加工條件下牛肉肌內膠原蛋白特性變化及其對品質影響研究[D]. 南京: 南京農業大學, 2010: 11.

[29] 毛衍偉. 快速冷卻和電刺激對牛肉品質的影響及其機理研究[D]. 泰安: 山東農業大學, 2011: 59.