蛋氨酸限制和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠脂代謝和氧化應激的聯合作用

王雅楠，張佳紅，郭海濤，樂國偉,2,*，施用暉,2

肥胖是由機體能量攝入量大于能量消耗量引起的一種慢性營養代謝失調癥，特別是高能量攝入以及低能量支出更易引發肥胖[1]。目前肥胖的發病率正以指數形式增加，已經成為了全球面臨的最嚴重的健康和經濟問題[2]。大量研究表明，長期高脂飲食使活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量生成，機體氧化還原平衡被打破，引起脂質過氧化，誘發脂代謝紊亂和肥胖，并導致心血管疾病、癌癥等的發生[3]。因此，研究如何有效控制和改善高脂飲食誘發肥胖的方法成為熱點，除了手術和藥物等方法外，人們更加關注飲食方式干預的方法，一方面是通過飲食中營養成分的限制，近20 年來飲食蛋氨酸限制（methionine restriction，MR）引起了廣泛的關注，因為飲食MR不需要進行食物限制，就可以減少機體脂肪的積累[4-5]，增加能量支出和代謝的靈活性[6]，增加胰島素敏感性，改善脂類代謝[7]，降低炎癥反應[8]，并且可以顯著延長多種生物體的壽命[9-11]；另一方面是通過生物活性物質的添加，大量研究表明，飲食中添加生物活性物質可以抑制高脂飲食誘導的肥胖，減少機體氧化應激及脂代謝的失調[12-14]。研究報道膠原蛋白肽具有抗氧化、抑制血壓上升、減緩動脈硬化和預防骨質疏松等功能[15]，李亞欣等[16]研究也表明膠原蛋白肽可有效提高小鼠機體抗氧化能力，緩解高脂飲食造成的氧化應激，改善血脂代謝。C57BL/6小鼠飲食MR可以抵抗飲食誘導的肥胖和胰島素抵抗，但是小鼠具有較低的骨密度[7]，研究報道膠原蛋白肽可以改善骨密度和骨質疏松[17-18]。膠原蛋白肽聯合MR對于骨小梁的厚度及單位骨強度的改善作用已有研究，但是飲食MR與生物活性物質膠原蛋白肽，對高脂飲食條件下肝臟氧化應激及脂代謝是否具有更好的改善作用鮮有報道。本實驗以C57BL/6小鼠為研究對象，利用高脂飲食研究飲食MR和膠原蛋白肽的聯合作用對于小鼠氧化還原狀態和脂代謝的影響，為肥胖脂代謝和氧化還原狀態的失衡提供營養學干預的參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級4 周齡雄性C57BL/6小鼠：SCXK（蘇）2015-0001，初始體質量為18～20 g，購自南京生物醫藥研究院。

蛋氨酸（食品級，蛋氨酸質量分數99.93%）、豬骨膠原蛋白肽（食品級，純度99%）均為市售；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）試劑盒、游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）試劑盒、蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色液、油紅O染色液 南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C） 上海豐匯醫學科技股份有限公司；BCA蛋白質量濃度測定試劑盒（增強型）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）碧云天生物技術研究所；Trizol 美國Biomiga公司；M-MLV逆轉錄酶、5×逆轉錄緩沖液 美國Promega公司；RNase抑制劑 南京生興生物技術有限公司；Oligo（dT）、基因引物 上海捷瑞生物工程公司；SYBR Green Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Epoch微孔板分光光度計 美國BioTek公司；5804R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；7900HT Fast實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國ABI公司；超微量分光光度計 上海采邑生物科技有限公司；超低溫冷凍冰箱 美國Thermo Scientific公司；ETC811 PCR儀 東勝興業科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼喂及分組

將36 只SPF級雄性C57BL/6小鼠用正常飼料預飼喂1 周后，按體質量隨機分為4 組，每組9 只：1）低脂正常蛋氨酸飲食組（ND組）：飼料中含4%（質量分數，下同）脂肪、0.86%蛋氨酸；2）高脂正常蛋氨酸飲食組（HF組）：飼料中含20%脂肪、0.86%蛋氨酸；3）高脂蛋氨酸限制飲食組（MR組）：飼料中含20%脂肪、0.17%蛋氨酸；4）高脂蛋氨酸限制與1%膠原蛋白肽聯合作用飲食組（PMR組）：飼料中含20%脂肪、0.17%蛋氨酸、1%膠原蛋白肽。飼料配方見表1。實驗小鼠飼養于SPF級動物房，同室分籠，每組3 籠，每籠3 只，環境溫度控制在（23±2）℃，相對濕度60%，12 h/12 h晝夜循環光照，保持飼養環境衛生。所有實驗小鼠均自由攝食和飲水，每周稱量并記錄體質量。

表1 飼料中各成分的質量分數Table 1 Compositions of experimental diets%

1.3.2 血液、組織樣品采集及肝臟指標的測定

每周稱體質量一次，22 周后，小鼠宰殺前禁食12 h，稱體質量后摘眼球取血入抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存備用。斷頸處死，在冰浴上迅速取肝臟，精確稱質量并記錄，并按照下式計算肝臟指數。

取部分肝臟組織加入預冷的生理鹽水，勻漿制得質量濃度為0.1 g/mL的組織勻漿，測定ROS后3 000 r/min離心10 min后取上清液，-20 ℃保存用于測定抗氧化水平；取100 mg左右肝臟組織置于Trizol試劑中，剪碎，-80 ℃保存，用于總RNA的提取；取部分肝組織浸入質量濃度為40 g/L多聚甲醛溶液中固定，4 ℃保存備用；另取相同部位，相同大小肝組織用OCT包埋劑（聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合液）包埋，液氮速凍后轉至-80 ℃凍存，以備冷凍切片的制作。

T-AOC、MDA和GSH-Px水平的測定均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

將50 mg小鼠凍存肝臟組織置于具有1 mL異丙醇中勻漿并進行超聲處理，勻漿經2 000×g離心，取上清液，嚴格按照TC和TG試劑盒測定肝臟TC和TG濃度。

1.3.3 肝臟HE和油紅O染色

HE染色：甲醛固定后的肝臟組織進行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸入石蠟包埋，預冷后切片（厚度5 μm）。嚴格按照試劑盒說明書將切片進行HE染色，滴少許中性樹膠封片，自然通風晾干，收集并鏡檢（200×）。

油紅O染色：將-80 ℃下OCT包埋備用的肝組織樣品固定在速凍臺上，調整合適的距離，切片厚度設為9 μm。嚴格按照試劑盒說明書進行進行油紅O染色，染色后滴適量水性固定液封片，自然通風晾干，收集并鏡檢（200×）。用Image-Pro圖像軟件進行分析，計算肝臟脂肪浸潤面積占整個視野面積的比例。

1.3.4 血漿指標測定

T-AOC、ROS、MDA、GSH-Px、TG、TC、HDL、LDL和FFA水平均按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 肝臟總RNA的提取及反轉錄

用Trizol法提取肝臟中的總RNA，然后加入適量DEPC水稀釋，通過測定溶液吸光度A260nm/A280nm比值確定所得RNA的純度，測得A260nm/A280nm在1.8～2.0時可用于下一步實驗。

取2.0 μg模板RNA，加入Oligo（dT） 2.0 μL、dNTP 2.0 μL、DEPC水4 μL，于70 ℃中水浴5 min，然后置于冰上冷卻；加入5×逆轉錄緩沖液5.0 μL、M-MLV逆轉錄酶0.5 μL、RNase抑制劑0.25 μL、DEPC水9.25 μL。擴增條件為：37 ℃，1.5 h；95 ℃，5 min；4 ℃冷卻。反轉錄所得cDNA于-20 ℃存放備用。

1.3.6 qPCR擴增

根據試劑盒說明書，以β-肌動蛋白為內標，測定脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA-carboxylase 1，ACC-1）、固醇調節元件結合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP1c）、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、對肉堿酰基轉移酶1（carnitine palmityl transferase 1，CPT1）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα）mRNA的表達量，引物如表2所示。

表2 qPCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for qPCR

使用ABI 7900 HT FAST qPCR儀檢測各模板的Ct值，通過2-△△Ct法計算，進行相對定量，反應體系如下：取0.5 μL cDNA模板，加入0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、5.0 μL SYBR Green Master Mix和3.7 μL無菌水，形成10 μL體系。擴增條件如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，以上步驟循環40 次；72 ℃終末延伸2 min；4 ℃冷卻恒定。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析和獨立樣本t檢驗，實驗均設9 組平行，結果以 ±s表示，P＜0.05或P＜0.01時，判斷組間差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠體質量的影響

圖1 蛋氨酸限制及膠原蛋白肽的干預對高脂飲食小鼠體質量的影響Fig. 1 Effects of MR and collagen peptides on body weight in HFD-fed mice

由圖1可知，各組小鼠初始體質量沒有顯著性差異（P＞0.05）。至第22周實驗結束時，與ND組相比，HF組小鼠體質量極顯著增加（P＜0.01）；與HF組相比，MR組小鼠體質量極顯著降低（P＜0.01）；與MR組相比，PMR組小鼠體質量極顯著降低（P＜0.01）。

2.2 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠采食量的影響

圖2 蛋氨酸限制及膠原蛋白肽的干預對高脂飲食小鼠采食量的影響Fig. 2 Effects of MR and collagen peptides on food intake of HFD-fed mice

由圖2可知，與ND組相比，HF組小鼠在第14周采食量顯著降低（P＜0.05），第21周采食量極顯著降低（P＜0.01）；與HF組相比，MR組小鼠在第7周和第14周采食量顯著增加（P＜0.05），第21周極顯著增加（P＜0.01）；與MR組相比，PMR組小鼠采食量在各周期無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠肝臟質量和肝臟指數的影響

圖3 蛋氨酸限制及膠原蛋白肽的干預對高脂飲食小鼠肝臟質量（A）及肝臟指數（B）的影響Fig. 3 Effects of MR and collagen peptides on liver weight (A) and index (B) in HFD-fed mice

由圖3可知，與ND組相比，HF組小鼠肝臟質量極顯著增加（P＜0.01），肝臟指數無顯著性差異（P＞0.05）；與HF組相比，MR組極顯著降低了高脂飲食小鼠的肝臟質量（P＜0.01），肝臟指數有下降趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）；與MR組相比，PMR組小鼠肝臟質量極顯著降低（P＜0.01），肝臟指數有下降趨勢，但沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠肝臟組織形態的影響

圖4 HE和油紅O染色（A）及油紅O染色中脂肪浸潤面積百分比（B）Fig. 4 HE and oil red O staining (A) and lipid accumulation of liver tissue (B) in HFD-fed mice

由圖4A可知，HF組小鼠肝臟脂肪大量囤積，肝細胞體積膨大，細胞內明顯發生脂肪變性；ND組、MR組和PMR組小鼠肝細胞形態結構清晰完整、排列緊密，細胞內有極少量脂肪空泡。肝臟冷凍切片經油紅O染色，通過Image-Pro圖像分析軟件測量冷凍切片相同視野中脂肪細胞浸潤所占比例，量化肝臟脂肪積累的情況。由圖4B可知，與ND組相比，HF組小鼠肝臟脂肪浸潤面積百分比極顯著增加（P＜0.01）；與HF組相比，MR組小鼠肝臟脂肪浸潤面積百分比極顯著降低（P＜0.01）；與MR組相比，PMR組小鼠肝臟脂肪浸潤面積百分比無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠肝臟TG和TC濃度的影響

圖5 蛋氨酸限制及膠原蛋白肽的干預對高脂飲食小鼠肝臟TG（A）及TC（B）濃度的影響Fig. 5 Effects of MR and collagen peptides on TG (A) and TC (B)levels in liver of HFD-fed mice

由圖5可知，與ND組相比，HF組小鼠肝臟TG和TC

濃度極顯著增加（P＜0.01）；與HF組相比，MR組小鼠肝臟TG和TC濃度極顯著降低（P＜0.01）；與MR組相比，PMR組小鼠肝臟TG濃度極顯著下降（P＜0.01），

TC濃度無顯著性差異（P＞0.05）。

2.6 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠血脂的影響

表3 蛋氨酸限制及膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠血脂的影響Table 3 Effects of MR and collagen peptides on plasma lipid profile of HFD-fed mice mmol/L

由表3可知，與ND組相比，HF組小鼠血漿TG、TC和FFA濃度極顯著增加（P＜0.01），LDL濃度顯著增加（P＜0.05），HDL濃度顯著降低（P＜0.05）；與HF組相比，MR組小鼠血漿TC和LDL濃度極顯著下降（P＜0.01），TG和FFA濃度顯著下降（P＜0.05），HDL濃度極顯著增加（P＜0.01）；與MR組相比，PMR組小鼠血漿TG和TC濃度顯著下降（P＜0.05），HDL、LDL和FFA濃度沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.7 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠脂代謝相關基因表達的影響

圖6 蛋氨酸限制及膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠脂代謝相關基因的影響Fig. 6 Effects of MR and collagen peptides on the expression of key lipid metabolism genes in liver

由圖6可知，與ND組相比，HF組小鼠肝臟脂肪合成相關基因SREBP1c、FAS和ACC-1 mRNA表達極顯著上調（P＜0.01），脂肪分解相關基因CYP7A1 mRNA表達顯著下調（P＜0.05），PPARα mRNA表達極顯著下調（P＜0.01）；與HF組相比，MR組小鼠肝臟脂肪合成相關基因FAS和SREBP1c mRNA表達極顯著下調（P＜0.01），ACC-1 mRNA表達顯著下調（P＜0.05），脂肪分解相關基因CYP7A1和PPARα mRNA表達極顯著上調（P＜0.01），CPT1 mRNA表達顯著上調（P＜0.05）；與MR組相比，PMR組小鼠肝臟脂肪合成相關基因SREBP1c和ACC-1 mRNA表達顯著下調（P＜0.05），FAS mRNA表達無顯著性差異（P＞0.05），脂肪分解相關基因CPT1和PPARα mRNA表達顯著上調（P＜0.05），CYP7A1 mRNA表達無顯著性差異（P＞0.05）。

2.8 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠肝臟氧化還原指標的影響

表4 蛋氨酸限制和膠原蛋白干預對小鼠肝臟氧化還原狀態的影響Table 4 Effects of MR and collagen peptides on hepatic redox indicators in HFD-fed mice

由表4可知，與ND組相比，HF組小鼠肝臟T-AOC和GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01），ROS和MDA含量極顯著增加（P＜0.01）；與HF組相比，MR組小鼠肝臟T-AOC和GSH-Px活力顯著增加（P＜0.05），ROS和MDA含量極顯著降低（P＜0.01）；與MR組相比，PMR組小鼠肝臟GSH-Px活力顯著增加（P＜0.05），T-AOC、MDA和ROS含量無顯著性差異（P＞0.05）。

2.9 飲食MR和膠原蛋白肽對高脂飲食小鼠血漿和血液氧化還原指標的影響

表5 蛋氨酸限制和膠原蛋白干預對小鼠血漿和血液氧化還原狀態的影響Table 5 Effects of MR and collagen peptides on redox indicators of plasma and blood in HFD-fed mice

由表5可知，與ND組相比，HF組小鼠血漿T-AOC和GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01），全血ROS和血漿MDA含量極顯著增加（P＜0.01）；與HF相比，MR組小鼠血漿T-AOC和GSH-Px活力極顯著增加（P＜0.01），全血ROS和血漿MDA含量極顯著降低（P＜0.01）；與MR相比，PMR組小鼠血漿T-AOC、GSH-Px活力、MDA含量和全血ROS含量無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

本研究顯示，飲食MR顯著抑制了高脂飲食小鼠體質量的增加，此結果與Malloy[4]、Ables[7]等研究結果一致。相比飲食MR，飲食MR和膠原蛋白肽的聯合作用顯著降低了小鼠體質量的增長，對高脂飲食小鼠體質量的降低有更顯著的效果。

肥胖患者一般都存在脂代謝紊亂，脂代謝紊亂最直觀的表現就是血脂（包括TC、TG、HDL-C和LDL-C等）異常。脂類的消化、吸收、運輸、分解代謝和合成代謝，都與肝臟有著密切的關系[19]，血漿中脂質的變化通常預示肝臟脂肪的生成或分解的變化。研究表明飲食MR除了可以顯著降低血漿TG和TC的水平[4]，還可以顯著減少小鼠[20]和大鼠[21]肝臟脂肪的積累。本實驗結果證實了飲食MR可以顯著降低血漿和肝臟TG和TC的含量、血漿LDL-C和FFA水平，顯著增加血漿HDL-C含量。膠原蛋白肽對于脂類代謝調控的積極作用也已經有實驗證實[16]。相比飲食MR組，飲食PMR組血漿TG和TC含量顯著下降，肝臟TG含量顯著下降，說明飲食MR和膠原蛋白聯合作用能夠更顯著改善高脂飲食小鼠血脂的異常和脂代謝的紊亂。

動物脂肪代謝與脂肪的合成、分解過程息息相關。有研究表明，飲食MR調控脂代謝合成和分解基因，改善肝臟脂代謝[22]。本實驗研究也證實飲食MR可以顯著下調小鼠肝臟脂肪合成相關基因（FAS、ACC-1和SREBP1c）的表達，顯著上調脂肪分解相關基因（CYP7A1、CPT1和PPARα）的表達。相比飲食MR組，飲食PMR組血漿TG和TC含量顯著降低，肝臟TG水平顯著下降，其原因一方面與脂肪合成相關基因（SREBP1c和ACC-1）表達顯著下調有關，SREBP1c是重要的核轉錄因子之一，能與脂質合酶基因的啟動子/增強子的固醇調節元件結合，激活靶基因轉錄，特異性調控膽固醇和脂肪酸代謝[23-24]；ACC-1是脂肪酸合成限速酶，催化脂肪酸合成的第一步反應[25]。通過下調ACC-1和SREBP1c的mRNA表達，說明飲食MR和膠原蛋白肽聯合作用可以下調脂肪合成相關基因，在轉錄水平進一步抑制了肝臟脂肪的合成，進而抑制血脂的升高；另一方面與PMR組脂肪分解相關基因（PPARα和CPT1）的顯著上調有關。PPARα作為過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）中的一個亞型，激活后可調節包括脂肪酸攝取、結合、氧化及脂質運輸在內的許多基因的表達，可有效改善血脂狀況，調節脂質代謝平衡[26]。CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶，可以使長鏈的乙酰輔酶A進入線粒體，促進脂肪酸β氧化[27]，通過PPARα和CPT1表達的顯著上調，在轉錄水平刺激β氧化，降低脂肪酸的水平，抑制TG合成，可能進一步降低體質量的增長，抑制高脂飲食條件下肥胖的發生。而CPT1和PPARα作為腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的下游基因，可能通過激活AMPK途徑，AMPK還可以通過抑制ACC-1的活性，減少丙二酰輔酶A的生成，從而解除丙二酰輔酶A對CPT1的抑制作用，抑制合成途徑的同時激活分解途徑，與機體肝臟脂肪變性有密切的關系，MR與膠原蛋白肽的聯合作用對于AMPK途徑的影響還需要進一步驗證。

越來越多研究表明，高脂飲食的攝取和脂肪組織的積聚可以顯著增加機體的氧化應激水平[28]。ROS和MDA水平的顯著增加，阻礙了線粒體對脂肪酸的氧化產能，導致血脂代謝異常，脂肪酸調節失衡。已經有研究證實飲食MR可以顯著改善高脂飲食條件下機體氧化還原狀態的失衡[29]，本實驗研究表明飲食MR可以顯著提高高脂飲食小鼠肝臟組織和血漿中T-AOC和GSH-Px的活力，降低血漿過氧化脂質產物MDA含量和全血ROS含量，也說明MR可以顯著降低高脂飲食小鼠的氧化應激反應，提高機體的抗氧化能力；相比飲食MR，飲食MR和膠原蛋白的聯合作用可以顯著提高肝臟組織GSH-Px的活力，說明飲食MR和膠原蛋白的聯合作用可能可以更有效改善高脂飲食誘導的氧化應激，促進機體抗氧化能力的提高，但其確切機制還需要進一步研究。

綜上所述，本研究表明，飲食MR具有降低高脂飲食小鼠體質量、血脂和肝臟脂肪積累，調節氧化應激的作用；而飲食MR和膠原蛋白的聯合作用對于高脂飲食小鼠體質量、血脂水平和肝臟脂肪積累的降低作用優于飲食MR的單獨作用。因此飲食MR和膠原蛋白肽的聯合作用，對于肥胖的預防和控制具有非常重要的研究價值和廣闊的應用前景。

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