干酪乳桿菌對不同劑量丙烯酰胺誘導大鼠腸道損傷的保護效果

李天嬌，張永杰，王子龍，劉 穎，梁 惠,*

丙烯酰胺（acrylamide，AM）是一種2A類致癌物，易溶于水，因此容易通過呼吸道、皮膚、消化道途徑吸收進入動物和人體。除了職業接觸外，食品、飲水、化妝品、香煙和衣物中都會含有丙烯酰胺，尤其是高溫加工的富含淀粉的食物。研究表明，丙烯酰胺會產生神經毒性、遺傳毒性、生殖毒性及致癌性[1-2]，還會導致小腸結構破壞。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，Lc）屬于益生菌的一種，能夠對宿主產生有益作用。研究發現，干酪乳桿菌對腫瘤生長具有一定的抑制效果[3]，可以提高機體抗氧化能力[4]，調節腸道菌群[5]，但是干酪乳桿菌能否改善丙烯酰胺誘導的腸道損傷的研究鮮有報道。因此，本研究以干酪乳桿菌為干預物，對大鼠小腸超微結構、血漿D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平以及腸道菌群進行觀察和檢測，從而探討干酪乳桿菌對不同劑量丙烯酰胺誘導大鼠腸道損傷的保護效果。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級Wistar大鼠105 只，雄性，體質量180～220 g，購自山東魯抗醫藥股份有限公司，許可證號：SCXK（魯）20140007。

活菌型乳酸菌乳飲品（干酪乳桿菌菌體濃度1×1011CFU/L） 天津養樂多乳品有限公司；D-LA和DAO酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海迪奧生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

半自動組織包埋機 英國Thermo Shandon公司；LKB-5超薄切片機 瑞典LKB公司；JEM1200EX透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；ELx808型酶標儀美國BioTek公司；BioPhotometer Plus6132型核酸蛋白檢測儀、Realplex4型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥方法

105 只雄性Wistar大鼠適應性喂養1 周后，按體質量隨機分為7 組：正常對照組，低、中、高劑量丙烯酰胺組（低、中、高劑量AM），干酪乳桿菌干預低劑量丙烯酰胺組（Lc+低劑量AM），干酪乳桿菌干預中劑量丙烯酰胺組（Lc+中劑量AM），干酪乳桿菌干預高劑量丙烯酰胺組（Lc+高劑量AM），每組15 只，每日給予充足的基礎飼料及飲水。按以下方法給藥：正常對照組，給予生理鹽水灌胃；低、中、高劑量丙烯酰胺組分別給予5、15、30 mg/（kg·d mb）丙烯酰胺灌胃；干酪乳桿菌干預低、中、高劑量丙烯酰胺組給予2.1×109CFU/（kg·d mb）乳酸菌飲品灌胃，同時分別給予5、15、30 mg/（kg·d mb）丙烯酰胺灌胃。實驗周期為4 周。

1.3.2 標本收集及指標檢測

末次灌胃后，采用代謝籠收集各組大鼠糞便各3～5 粒，-80 ℃凍存備用。禁食12 h后，60 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹主動脈取血，留取小腸組織，取距回盲瓣近心端5 cm處的回腸組織進行固定用于觀察超微結構，分離血漿，用于后續實驗。

1.3.3 腸組織超微結構觀察

將1 mm3腸組織用體積分數2.5%戊二醛溶液固定4 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗；體積分數1%鋨酸溶液固定1 h，PBS漂洗；丙酮逐級脫水；環氧樹脂（EPONB12）包埋，溫箱固化。超薄切片機切片，厚度50～70 nm，3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。

1.3.4 干酪乳桿菌對大鼠血漿中D-LA和DAO水平的影響

檢測方法按照ELISA試劑盒說明書進行，用酶標儀測450 nm波長處吸光度，根據標準曲線得出D-LA和DAO水平。

1.3.5 干酪乳桿菌對大鼠腸道菌群的影響

標準菌株DNA提取：分別將標準菌株大腸桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、脆弱擬桿菌及柔嫩梭菌凍干粉溶于200 μL PBS中，采用細菌基因組提取試劑盒提取標準菌株基因組DNA，具體步驟嚴格按說明書操作，-20 ℃保存。

PCR引物設計：參照文獻[6]設計大腸桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、脆弱擬桿菌及柔嫩梭菌等特異菌株16S rDNA引物序列，見表1。

表1 特異菌屬16S rDNA片段PCR擴增引物序列及退火溫度Table 1 Species-specific 16S rDNA primer sequences and annealing temperatures for real-time PCR

標準曲線制作：將所得6 種標準菌株的DNA片段回收純化后作為實時熒光定量PCR的標準品，以核酸蛋白檢測儀測定其濃度，換算為1 μL各標準品的拷貝數用于制作標準曲線。將各標準品以10 倍體積系列稀釋，使之成為l×107～1×102拷貝數/μL，作為標準品，進行以SYBR Green為熒光染料的實時熒光定量PCR。反應體系25 μL，其中dNTP 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，細菌基因組DNA模板2.0 μL（50 ng/μL）。反應條件為預變性95 ℃，15 min；變性95 ℃，10 s；最佳退火溫度（表1）20 s；延伸72 ℃，30 s；共50 個循環，反應完畢后進行溶解曲線分析。根據讀取的熒光數據，由系統軟件Mastercycler ep realplex自動分析Ct值，并生成標準曲線。

待測樣品16S rDNA定量分析：將待測糞便樣品提取腸道菌群DNA后分別進行6 種細菌的16S rDNA實時熒光定量PCR，反應體系和反應條件與標準曲線制備時相同。每次實驗同時設標準品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對照，每個樣品均同時做2 個平行復孔。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析，數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，組內比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 干酪乳桿菌對小腸組織超微結構的影響

圖1 大鼠小腸組織透射電子顯微鏡觀察Fig. 1 Transmission electron microscopic images of small intestine from rats

表2 干酪乳桿菌對大鼠小腸組織微絨毛長度的影響Table 2 Effect of Lactobacillus casei on microvilli length in rats

由圖1和表2可知，正常對照組小腸微絨毛豐富，細胞間緊密連接，結構清晰完整；與正常對照組相比，低劑量丙烯酰胺組小腸微絨毛長度無明顯變化（P＞0.05），中、高劑量丙烯酰胺組小腸緊密連接腫脹，微絨毛排列稀疏，微絨毛長度分別縮短了17.6%和36.2%，具有顯著性差異（P＜0.05）；干酪乳桿菌干預后，大鼠小腸微絨毛排列情況均得到不同程度的改善，緊密連接腫脹減輕，微絨毛長度分別增長了42.9%、50.1%和29.8%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 干酪乳桿菌對大鼠血漿中D-LA和DAO水平的影響

表3 干酪乳桿菌對大鼠血漿中D-LA和DAO水平的影響Table 3 Effect of Lactobacillus casei on on plasma D-LA and DAO levels in rats from different groups

由表3可知，與正常對照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠血漿中D-LA和DAO水平明顯升高（P＜0.05）；干酪乳桿菌干預后，大鼠血漿中D-LA和DAO水平顯著降低（P＜0.05）。

2.3 干酪乳桿菌對大鼠腸道菌群的影響

表4 干酪乳桿菌對大鼠腸道菌群的影響Table 4 Effect of Lactobacillus casei on intestinal microbiota in rats拷貝數/g

由表4可知，與正常對照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數量明顯升高（P＜0.05），雙歧桿菌和乳桿菌的數量明顯降低（P＜0.05），脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數量無明顯變化（P＞0.05）；干酪乳桿菌干預后，大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數量均有不同程度的減少，雙歧桿菌和乳桿菌的數量均有不同程度增加，脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數量無明顯變化（P＞0.05）。

3 討 論

自從2002年瑞典的研究人員首次在油炸、高溫烘烤的淀粉食品（如薯條、薯片等）中發現丙烯酰胺后[7]，這種化學物質對人體的危害性引起了社會的高度關注。丙烯酰胺是一種中等毒性的親神經毒物，水溶性強，易被生物體的消化道、皮膚、肌肉或其他途徑吸收，從而造成急性、亞急性或慢性中毒。研究人員發現，丙烯酰胺會對腸道功能造成影響，它可以誘導腸上皮細胞的氧化損傷[8]，破壞小腸絨毛的完整性[9]，降低小腸絨毛長度、隱窩數量和小腸的吸收面積[10]。丙烯酰胺屬于脂肪族酰胺，可以在酰胺酶或酰胺水解酶的催化下進行脫氨基作用，產生氨和丙烯酸。丙烯酸可以轉化為丙酸或者β-羥基丙酸、乳酸和CO2[11]。已有研究表明，一些腸道微生物可以產生酰胺酶[12]，那么，調節腸道微生物對因長期攝入丙烯酰胺造成的腸道損傷是否具有改善作用值得人們深入研究。益生菌是一類能夠對宿主產生有益作用的活體微生物，可以降低腸道通透性，保護腸黏膜屏障功能，調節腸道微生物[13-16]。2001年我國衛生部發布了可用于保健食品的益生菌菌種名單，主要包括：雙歧桿菌類、乳桿菌類以及嗜熱鏈球菌。干酪乳桿菌屬于乳桿菌類，被廣泛應用于乳制品中，具有抑制腫瘤生長、調節機體免疫功能、保護小腸黏膜、調節腸道菌群等多種有益作用[3-5]。因此，本研究選擇乳酸菌飲品（所含菌種只有干酪乳桿菌）作為干預物，探討干酪乳桿菌能否通過調節腸黏膜屏障功能和腸道菌群，改善丙烯酰胺所誘導的腸道損傷。

本研究通過丙烯酰胺灌胃的方法建立大鼠丙烯酰胺腸道損傷的模型。透射電子顯微鏡結果顯示，中、高劑量丙烯酰胺組小腸緊密連接腫脹，微絨毛排列稀疏，微絨毛長度顯著縮短，說明中、高劑量丙烯酰胺組已經成功誘導了大鼠小腸組織損傷；而干酪乳桿菌干預后，大鼠小腸微絨毛排列情況均得到不同程度的改善，緊密連接腫脹減輕，微絨毛長度顯著增長，表明干酪乳桿菌對大鼠的小腸組織具有一定的保護作用。

血漿D-LA和DAO水平是監測腸道屏障功能的重要指標，它們可以很好地反映腸黏膜屏障的破壞程度。D-LA是由腸道菌群發酵而產生的代謝終產物；DAO是存在于哺乳動物腸黏膜上皮絨毛中具有高度活性的細胞內酶。研究表明，當機體處于生理狀態時，血中的D-LA和DAO水平均較低。當腸黏膜屏障受損時，大量的D-LA和DAO會通過腸黏膜釋放入血，從而導致血漿中D-LA和DAO水平升高[17-18]。本研究結果顯示，與正常對照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠血漿中D-LA和DAO水平明顯升高，說明中、高劑量丙烯酰胺會在一定程度上造成大鼠腸黏膜屏障破壞；干酪乳桿菌干預后，大鼠血漿中D-LA和DAO水平顯著降低，說明攝入干酪乳桿菌可以修復大鼠腸黏膜屏障功能，改善丙烯酰胺造成的腸道損傷。

腸道菌群在維持腸道內環境，保護腸道健康等方面起著重要的作用。在機體腸道中存在著大量的微生物，它們按照一定的數量和比例，對宿主發揮著許多重要的生理功能，這些微生物即腸道菌群。研究發現，腸道菌群可以調節能量水平和代謝，中和藥物和致癌物，調節腸動力，調節免疫和屏障功能，防止病原體的入侵[19-21]。一旦發生腸道菌群失調，就會對許多疾病產生影響，尤其是一些腸道疾病，如潰瘍性結腸炎、結直腸癌、腸易激綜合征等[22-26]。已有研究表明，益生菌制劑可以調節腸道菌群[27]，其機制可能與它們所產生的抵抗致病物質的維生素、抗氧化物以及防御素有關[28]，還可能與它們產生短鏈脂肪酸、降低毒性有關。許多益生菌屬于革蘭氏陽性菌，不含脂多糖，比如雙歧桿菌和乳桿菌。這些菌種會與病原體競爭營養物質或腸壁上的受體，從而減少感染的風險[29]。研究發現，補充益生菌可以增加乳桿菌和雙歧桿菌的數量，減少大腸桿菌和糞腸球菌的數量，從而達到調節腸道內環境的目的[30-31]。本研究結果顯示，與正常對照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數量明顯升高，雙歧桿菌和乳桿菌的數量明顯降低，脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數量無明顯變化，說明中、高劑量丙烯酰胺會造成一些腸道菌群的改變，影響腸道功能；經干酪乳桿菌干預后，大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數量均有不同程度的減少，雙歧桿菌和乳桿菌的數量均有不同程度增加，脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數量無明顯變化，說明干酪乳桿菌可以調節大鼠的腸道菌群，保護腸道內環境穩定。

綜上所述，長期攝入一定量的丙烯酰胺會造成大鼠腸黏膜屏障破壞和腸道菌群改變，而補充干酪乳桿菌在一定程度上可以保護丙烯酰胺所誘導的腸道損傷，其機制可能與改善腸黏膜屏障功能，調節腸道菌群有關。這提示干酪乳桿菌在修復腸道損傷的研究中具有廣泛的應用前景。

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