鮑內臟多糖體內抗氧化及增強小鼠免疫活性

魏好程，邵 杰，何傳波，李 漫，熊何健*

自由基是人體生命活動中各種生化反應的中間代謝產物，因其單電子的結構而表現出極其活潑的不穩定性[1]，人體內自由基的過量積累會造成機體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種不可逆的氧化損傷[2]，引起機體免疫功能下降，導致機體衰老。食品中含有多種抗氧化物質，生命組織中也存在多種內源性抗氧化物質協同維持機體內生命過程中自由基的平衡。

近年來，科學家不斷地從海洋生物中發現一些具有抗氧化活性和增強機體免疫力的化合物，其中多糖類物質因易被生物體吸收，通過清除體內自由基，表現出較強的抗氧化作用和其他生物活性而受到人們的關注。鮑是我國極具經濟價值的水產品之一，近年來因人工養殖技術鮑產量得以大幅提升，2015年我國鮑養殖量12.8萬 t，其中福建省鮑產量10.0萬 t，經濟產值已經超過100億 元，鮑產業已成為福建省海洋漁業的重要支柱產業之一[3]。鮑在加工過程中會產生約自身體質量35%的內臟下腳料，常被直接丟棄，不僅污染環境，而且造成資源浪費[4]。鮑內臟包含肝胰腺、腎臟、性腺等內臟組織，還含有鮑消化后的產物。酶解后的鮑內臟含有豐富的消化酶、蛋白肽、多糖和脂肪酸等生理活性物質，是海洋活性功能物質的良好來源[5-6]，鮑內臟的精深加工已成為產業發展的迫切需求。

已有研究表明，鮑臟器中存在多種清除自由基、促進淋巴細胞增殖、抑制腫瘤細胞生長的活性成分，表現出抗氧化、增強機體免疫和抗癌等功能活性。王姣等[7]研究表明鮑內臟多糖（abalone visceral polysaccharides，AVP）對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基具有良好的清除作用。陳秀琴[8]運用酶解法發現鮑內臟蛋白肽也能很好地體外清除自由基活性，表現出良好抗氧化功效。蘇永昌等[9]采用不同種類蛋白酶酶解提取鮑內臟多糖后發現，胃蛋白酶對鮑內臟多糖提取效果最好，得到的各組多糖均表現出良好的抗氧化作用，而何傳波等[10]利用堿性蛋白酶制備的鮑內臟蛋白肽，表現出較好的體內抗氧化活性。程婷婷等[11]從鮑臟器中分離純化出一種多糖，表現出一定的體外抗腫瘤活性。朱莉莉[12]、王蒞莎[13]等分別從鮑內臟中分離提取的鮑內臟多糖，能顯著抑制H22肝癌細胞生長，以及對HeLa和K562細胞具有一定程度的抑制作用，表現出抗腫瘤活性和增強免疫活性。相關研究報道多聚焦于鮑內臟多糖和多肽的功能活性研究，但功能活性實驗多停留在體外實驗和細胞實驗階段，關于鮑內臟多糖對動物體內實驗的相關報道還很有限。

本研究在課題組已有的二次酶解技術工藝制備鮑內臟多糖的基礎上，結合前期已取得的體外抗氧化研究結果[7,14]，開展鮑內臟多糖體內抗氧化及增強小鼠免疫活性的研究，以期為鮑的綜合利用及產業發展提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性KM小鼠、SPF級雄性BALB/C小鼠，體質量（18±2）g，均購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2012-0002。分籠飼養，每天光照12 h，動物房環境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食進水，每天更換飼料、飲水和墊料，進行7 d適應性喂養。

鮑內臟多糖由集美大學食品與生物工程學院功能性食品研究實驗室自制。經高效液相色譜檢測，實驗用鮑內臟多糖樣品含有甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖7 種單糖，總糖含量49.6%。

總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒、蛋白質羰基測試盒、考馬斯亮藍測試盒 南京建成試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JDC-0.2真空冷凍干燥機 廈門柏嘉生物科技有限公司；RNF0460-011多功能卷式膜小試設備 廈門福美科技有限公司；UV-8000A紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀美國DIONEX公司。

1.3 方法

1.3.1 體內抗氧化活性動物實驗分組及給藥實驗設計

實驗參照[2012]107號《關于印發抗氧化功能評價方法等9 個保健功能評價方法的通知》中抗氧化功能評價方法[15]，將70 只KM小鼠適應環境后，隨機分為7 組，每組10 只，設定為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、鮑內臟多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組。各劑量組給藥劑量參照《抗氧化功能評價方法》[15]、Finkel[16]和羅曉航[17]等動物實驗劑量設定方法，略作調整。中劑量組給藥劑量設定為人體臨床用量的10 倍（小鼠），高劑量組給藥劑量設定為人體臨床用量20 倍，低劑量組給藥劑量設定為人體臨床用量的5 倍。其中，陽性對照組抗壞血酸為人體攝入量的5 倍，即10 mg/kg劑量VC溶液每天灌胃0.5 mL，鮑內臟多糖低、中、高劑量組分別以200、400、800 mg/kg劑量每天灌胃0.5 mL，空白對照組和模型對照組每天灌胃等體積的0.5 mL生理鹽水。

1.3.2 乙醇氧化損傷模型動物實驗設計

參照《抗氧化功能評價方法》中乙醇氧化損傷模型造模方法[15]，實驗期間小鼠自由攝食和飲水，每天上午8：00進行灌胃。小鼠連續灌胃30 d后，除空白組外，其他各組小鼠禁食16 h后一次性給予體積分數50%乙醇溶液12 mL/kg劑量灌胃處理，6 h后將小鼠處死解剖，取出肝臟，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干表面水分后用生理鹽水低溫勻漿，制備勻漿液，2 000 r/min離心10 min，留上清液，待測。

1.3.3 體內抗氧化活性指標測定

SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測定。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法測定。GSH含量采用硫代二硝基苯甲酸顯色分光光度法測定。其中樣本蛋白質量濃度采用考馬斯亮藍顯色分光光度法測定，根據式（1）計算；蛋白質羰基含量采用分光光度法測定，根據式（2）計算。以上4 項指標檢測操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 增強免疫力動物實驗分組及給藥實驗設計

實驗選擇正常動物模型，將60 只BALB/C小鼠適應環境后，隨機分為6 組，每組10 只，設定為空白對照組、陽性對照組、鮑內臟多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組。其中空白對照組每天灌胃0.5 mL生理鹽水，陽性對照組以25 mg/kg劑量鹽酸左旋咪唑每天灌胃0.5 mL，鮑內臟多糖低、中、高劑量組分別每天以200、400、800 mg/kg劑量灌胃0.5 mL。實驗期間小鼠自由攝食和飲水，每天上午8：00進行灌胃，連續灌胃30 d后稱質量，各組小鼠根據檢測指標方法進行相應處理取樣，各動物模型實驗設計參照1.3.1節所述。

1.3.5 增強免疫力功能指標測定

免疫力活性功能評價采用免疫器官指數、細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫中單核-巨噬細胞功能進行綜合評價。其中體質量和免疫器官指數采用稱質量法測定；遲發型變態反應（delayed type hypersensitivity，DTH）測定采用足跖增厚法；血清溶血素抗體水平測定采用血凝法；小鼠碳廓清實驗采用校正吞噬指數法，各項檢測方法參照《增強免疫力功能評價方法》[18]要求進行。

1.4 數據分析

實驗數據均以 ±s表示，使用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）中的鄧肯氏多重比較分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 鮑內臟多糖對小鼠體質量的影響

按照1.3.1節方法，灌胃30 d前后，分別對各實驗組小鼠進行體質量測量，實驗數據如表1所示。

表1 鮑內臟多糖對小鼠體質量的影響（n＝10）Table 1 Effect of AVP on body weight of mice (n= 10)

由表1可知，各實驗組小鼠灌胃前體質量無顯著差異（P＞0.05），表明實驗用小鼠體質量個體差異不顯著，實驗具有統計學意義。連續灌胃30 d后，各組小鼠之間的體質量均無顯著差異（P＞0.05），各組小鼠灌胃前后體質量的增加量也無顯著差異（P＞0.05）。表明鮑內臟多糖對小鼠體質量無顯著影響，對小鼠毒副作用較小。

2.2 鮑內臟多糖對乙醇氧化損傷模型小鼠肝臟中SOD活力和GSH、MDA、蛋白質羰基含量的影響

基于不同原理的各種抗氧化活性檢測和評價方法，能從不同機理反映抗氧化活性物質的多種功能特性[19]。但由于抗氧化反應的多樣性和復雜性，加之各種方法自身局限性，尚未形成一種標準方法[20]。本實驗在課題組已有的鮑內臟多糖體外抗氧化實驗的基礎上[7]，選擇SOD活力和GSH、MDA、蛋白質羰基含量作為體內抗氧化活性綜合評價指標。乙醇氧化損傷模型動物實驗各組小鼠肝臟中SOD活力和GSH、MDA、蛋白質羰基含量變化如表2所示。

表2 鮑內臟多糖對小鼠肝臟中SOD活力和GSH、MDA、蛋白質羰基含量的影響（n＝ 10）Table 2 Effect of AVP on SOD activity, GSH, MDA and protein carbonyl content in liver of mice (n= 10)

SOD是一種源于生命體的活性物質，是生物體內重要的抗氧化酶，可以保護細胞免受自由基攻擊[21-22]。而GSH在生物體內作為一種還原劑能消除機體內的過氧化氫及脂質過氧化物，可以防止細胞膜與其他生物組織免受過氧化損傷[23-24]。MDA是脂質過氧化的主要產物，能引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，具有細胞毒性，其含量與細胞氧化損傷的程度呈正相關[25]。機體內蛋白質羰基作為蛋白質氧化的產物，是體內蛋白質遭到自由基攻擊的重要標志，其含量間接反映了機體內蛋白質抵抗自由基攻擊的能力[26-27]。

由表2可知，模型對照組小鼠肝臟內SOD活力、GSH含量極顯著低于空白對照組（P＜0.01），而MDA和蛋白質羰基含量極顯著均高于空白對照組（P＜0.01），表明乙醇氧化損傷動物造模實驗設計成功。

乙醇氧化損傷模型小鼠經鮑內臟多糖中、高劑量灌胃處理后，小鼠肝臟中SOD活力均極顯著高于模型對照組（P＜0.01）、GSH含量均顯著高于模型對照組（P＜0.05）。同時，數據表明鮑內臟多糖各處理組中小鼠肝臟SOD活力、GSH含量與灌胃劑量呈現正相關性。鮑內臟多糖中劑量組小鼠肝臟SOD活力比乙醇氧化損傷模型對照組小鼠肝臟中SOD活力提高了20.6%，而GSH含量提高了1.02 倍。表明鮑內臟多糖能增強小鼠體內SOD活力和提高GSH含量，減輕超氧陰離子自由基損傷，幫助氧化損傷機體GSH含量恢復正常水平，提高機體的抗氧化能力。

經鮑內臟多糖、中、高劑量灌胃處理后，小鼠肝臟中MDA含量均極顯著低于模型對照組（P＜0.01），蛋白質羰基含量均顯著低于模型對照組（P＜0.05）。同時，數據表明鮑內臟多糖處理組小鼠肝臟中MDA含量、蛋白質羰基含量與灌胃劑量呈現負相關性。鮑內臟多糖中劑量組小鼠肝臟中MDA含量比乙醇氧化損傷模型對照組小鼠肝臟中MDA含量降低了56.2%，而蛋白質羰基含量降低45.4%。表明鮑內臟多糖都具有清除體內氧自由基、拮抗氧自由基對蛋白質的攻擊、降低體內脂質過氧化程度和蛋白質的氧化損傷程度的作用。

另外，鮑內臟多糖中劑量組小鼠肝臟中GSH含量、MDA含量和蛋白質羰基含量3 項檢測指標與相對應的陽性對照組無顯著差異（P＞0.05），鮑內臟多糖高劑量組中SOD活力與相對應的陽性對照組無顯著差異（P＞0.05），這表明鮑內臟多糖具有良好的體內抗氧化活性。

2.3 鮑內臟多糖對小鼠免疫力的影響

免疫功能與健康密切相關，增強機體的免疫功能是疾病治療和機體康復的重要途徑。在增強免疫力功能評價中有多種指標和方法從不同角度反映供試樣品體內增強小鼠免疫力的能力。本實驗中鮑內臟多糖對增強小鼠免疫力的影響如表3所示。

免疫器官指數包括胸腺或脾臟的相對質量，可反映機體免疫細胞的生長發育、增殖及功能狀態。DTH是由致敏性T細胞介導的一種細胞免疫反應，是細胞免疫的體內檢測法，其通過測定小鼠的局部腫脹程度（足跖增厚）可以反映DTH的反應強度。血清溶血素水平反映機體形成抗體的能力，揭示小鼠體內B細胞增殖分化產生抗綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）抗體（溶血素）的水平，以此來評價機體的體液免疫功能[28]。碳廓清法常被用來檢測機體的非特異性免疫功能，反映機體單核-巨噬細胞的吞噬能力。增強機體免疫力功能評價中常采用免疫器官指數、細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫作為功能活性物質增強免疫力的一項綜合指標[29]。

表3 鮑內臟多糖對小鼠免疫器官指數、DTH、血清溶血素抗體水平和碳廓清能力的影響（n＝10）Table 3 Effect of AVP on immune organ indices, DTH, serum hemolysin and carbon clearance in mice (n= 10)

由表3可知，鮑內臟多糖低、中、高各劑量組與空白對照組相比均能夠顯著提高小鼠脾臟指數和小鼠胸腺指數（P＜0.05）。鮑內臟多糖各劑量組小鼠的足跖腫脹程度、溶血素抗體水平均極顯著地高于空白對照組（P＜0.01），吞噬指數顯著高于空白對照組（P＜0.05）。其中，鮑內臟多糖中劑量組小鼠脾臟指數和胸腺指數比空白對照組分別提高21.9%和152%；小鼠足跖增厚度比空白對照組提高了40.3%；小鼠血清溶血素抗體水平比空白對照組提高了49.3%；小鼠單核-巨噬細胞碳廓清吞噬指數提高了10%。比較鮑內臟多糖不同劑量組的各項指標發現，除了免疫器官指數和吞噬指數外，其余指標均呈現量效關系，且效果優于陽性對照。研究表明鮑內臟多糖能夠提高小鼠免疫器官指數、提高小鼠足跖腫脹程度、提高小鼠血清的抗體水平和提高小鼠的吞噬指數，從免疫器官指數、細胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫方面均表現出有良好的增強免疫力活性功能。

3 討 論

通過乙醇氧化損傷模型實驗，鮑內臟多糖可顯著提高模型小鼠肝臟SOD活性、顯著提高小鼠體內GSH含量、顯著降低小鼠體內MDA和蛋白質羰基含量。對輔助清除氧化模型小鼠體內超氧陰離子、保護細胞膜結構和功能完整性、減少細胞損傷和降低體內脂質過氧化和蛋白質氧化損傷方面均有良好作用。

鮑內臟多糖低、中、高劑量組與提高乙醇氧化損傷模型小鼠SOD活性和提高GSH含量呈顯著正相關性；與降低小鼠體內MDA和蛋白質羰基含量呈顯著負相關性。中劑量鮑內臟多糖處理組小鼠體內抗氧化指標除SOD活力外其他與陽性對照組無顯著差異，高劑量組小鼠SOD活力與陽性對照組無顯著差異，這與課題組先前開展的鮑內臟多糖體外抗氧化活性研究中鮑內臟多糖對H2O2損傷的LO2細胞中GSH-Px、SOD活力和MDA含量的影響與多糖劑量呈顯著正相關性和高劑量處理組兩項指標均優于陽性對照組的結果基本一致[7]，表明鮑內臟多糖通過促進機體和細胞內抗氧化酶活性，減少有毒過氧化產物實現抗氧化作用，與Zhai Li等[30]在川芎嗪衍生物的作用機理是一致的。根據《抗氧化功能評價方法》中結果判定依據，動物實驗中脂質氧化產物、蛋白質氧化產物、抗氧化酶、抗氧化物質4 項指標中3 項陽性，可判定該受試樣品抗氧化功能動物實驗結果陽性，表明鮑內臟多糖具有一定的抗氧化活性。

在增強小鼠免疫力功能評價中，鮑內臟多糖能夠極顯著提高小鼠脾臟指數和小鼠胸腺指數、足跖增厚，極顯著提高小鼠溶血素抗體水平，顯著提高小鼠吞噬指數；在免疫器官指數、細胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫方面均表現出有良好的增強免疫力活性功能，并且與多糖灌胃劑量呈現一定的量效關系；參照《增強免疫力功能評價方法（征求意見稿）》中結果判定方法，正常小鼠動物模型中4 項指標為陽性，可判定該受試樣品增強小鼠免疫力結果陽性，表明鮑內臟多糖具有增強小鼠免疫力功能。

食品加工技術對生物活性多糖結構和功能特性的影響是十分顯著的[31]，目前多采用較為溫和的生物酶解技術進行活性物質提取。本研究利用酶解技術提取的鮑內臟多糖和劉娜等[5]利用酶解技術提取的鮑性腺多糖分別在乙醇氧化損傷模型小鼠和高脂血癥大鼠中表現出良好的體內抗氧化能力結果一致。另外，本研究所用的鮑內臟多糖采用工業化生產工藝流程制備，鮑內臟多糖的成分還相對復雜，與先前分離純化的單一活性多糖在體外抗氧化活性功能上還具有差異性[7]，保健功能因子的分離、純化及各組分活性驗證還需大量數據支持。實驗結果為鮑內臟的有效利用提供了理論依據，可以極大地減少優質海洋生物資源的浪費和環境污染，對提高鮑產品提升經濟價值、完善產業鏈起到積極的推動作用。

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