肉桂醛在殼聚糖復合活性包裝膜中的釋放及在鮮豬肉冷藏中的應用

曾少甫，胡長鷹,,*，匡衡峰，黃 程，吳宇梅

活性包裝正逐漸成為食品包裝領域中的一個新興焦點，其利用聚合物材料本身的性能以及將某些食品添加劑納入包裝系統（置于包裝內部或納入包裝材料本身），通過所產生的材料擴散行為，釋放對食品保鮮具有積極作用的物質，提供阻隔外部并且作用于內部包裝環境的條件，從而起到保持產品質量和延長保質期的作用[1]。活性包裝除了可以延長食品的保質期外，還具有改善食品感官特性、防止食物營養成分損失等優點[2]。

殼聚糖（chitosan，CS）是甲殼素在堿性介質中的脫乙酰化產物[3]，其來源廣[4]，被公認為無毒、可降解的環境友好型包裝材料[5]，常以溶液澆鑄法制備成膜并應用于食品包裝中[6]。已有研究表明，殼聚糖有良好的生物相容性，其與天然活性物質結合而成的復合膜能使食品貯藏期間的品質及保鮮程度得到改進。如Qin Yuyue等[7]開發了一種結合茶多酚的殼聚糖膜用于豬肉的保鮮；Vargas等[8]研究了含有向日葵油的殼聚糖復合膜在豬肉漢堡中的抗氧化作用；張慧蕓等[9]研究了丁香精油-殼聚糖復合可食性膜對生肉糜的貯藏影響，都得到良好的應用效果。肉桂醛（cinamaldehyde，CIN）是天然植物肉桂樹的次生代謝產物肉桂精油中的一種主要物質，對大部分微生物有抗菌作用，特別是常見的肉類腐敗微生物，如大腸桿菌、產氣桿菌、腸桿菌屬成團泛菌和英諾克李斯特氏菌[10-12]。同時，肉桂醛也屬于食品風味添加劑[13-14]。肉桂醛具有高正辛醇/水分配系數，能更好地溶解、擴散和滲透到普通的材料中制備成抗菌膜[15]。肉桂醛也有一定的揮發性[16]，將其加入殼聚糖并設計成可控食品貯藏系統有著廣泛的應用意義，因此研究其釋放行為具有必要性[17-18]。

本課題組之前的研究已證明以殼聚糖為基底摻入天然活性劑肉桂醛制備成復合膜的可行性以及高抗菌性[19]，本研究主要利用氣相色譜-質譜儀對復合膜中肉桂醛含量進行檢測，對于復合膜中活性成分肉桂醛在聚合物基體殼聚糖中的釋放影響因素進行分析，分別研究了不同溫度、肉桂醛體積分數下肉桂醛向空氣和向脂溶性食品模擬液異辛烷中的釋放規律，并將其應用于新鮮豬肉的保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊肉由廣州市永旺購物中心提供。

殼聚糖（分析純，脫乙酰度≥90.0%）、肉桂醛（分析純、色譜純）、甘油（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；乙酸（分析純） 廣州化學試劑廠；吐溫-80（分析純） 天津化學試劑廠；甲醇（色譜純）、異辛烷（色譜純） 德國Merker公司；平板計數瓊脂 青島海博生物技術有限公司；聚乙烯保鮮膜（30 cm×20 m） 廣州家亮化工有限公司。

1.2 儀器與設備

成膜器（15 cm×25 cm有機玻璃板）由廣東省普通高校產品包裝與物流重點實驗室自制；7890A-5975C氣相色譜-質譜儀 美國安捷倫科技有限公司；TG 209 F3熱重（thermogravimetric，TG）分析儀 德國NETZSCH公司；SPX-100B-Z恒溫培養箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；PHS-25型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；STD-XG001型半微量凱氏定氮快速檢測儀廈門斯坦道科學儀器股份有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海培因實驗儀器有限公司；BCD-196TXZ型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖-肉桂醛復合膜的制備

稱取一定量的殼聚糖溶于乙酸中配制成體積分數1.5%的溶液，在25 ℃下磁力攪拌4 h至殼聚糖完全溶解。將體積分數3%甘油作為增塑劑加入殼聚糖溶液中，攪拌混合30 min，加入體積分數0.5%吐溫-80作為乳化劑協助肉桂醛分散溶解，攪拌混合30 min。分別加入體積分數為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的肉桂醛于殼聚糖膜液中，攪拌混合30 min后形成肉桂醛/殼聚糖溶液，經過真空泵1 h去除氣泡。利用流延法將成膜溶液（100 mL）于平板玻璃板上在鼓風干燥箱中干燥成膜（40 ℃、24 h），成膜保存于25 ℃、相對濕度53%的干燥器中48 h，平衡后檢測。

1.3.2 TG分析

通過TG 209 F3熱重分析儀對膜熱穩定性進行分析。稱取膜4.0～5.0 mg，樣品事先在50 ℃下除濕干燥48 h，以氮氣作為載氣，實驗溫度30～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，記錄TG曲線、微分熱重（derivative thermogravimetry，DTG）曲線。

1.3.3 復合膜中肉桂醛初始含量的測定

通過分析預實驗的結果，采用甲醇作為膜中肉桂醛的提取溶劑。準確稱取不同肉桂醛體積分數（分別為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的復合膜0.050 0 g，放入10 mL的試管中，加入5.0 mL甲醇，塞緊試管，用封口膠密封，放置于超聲波清洗機中萃取30 min，一定倍數稀釋，萃取液經0.45 μm有機濾膜過濾，進行氣相色譜-質譜檢測，每組平行檢測5 次。初始含量按式（1）計算。

式中：C0為肉桂醛在復合膜中的初始含量/（mg/kg）；ρf為檢測所得肉桂醛質量濃度/（mg/L）；V為提取肉桂醛時的定容體積/L；F為提取時所稀釋的倍數；m為復合膜的質量/kg。

色譜條件：色譜柱為Agilent 19091S-433HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序為起始溫度40 ℃，保持2 min，以20 ℃/min的速率升溫至130 ℃，再以30 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持2 min；進樣方式為分流進樣，分流比20∶1，進樣量為1 μL；進樣口溫度為280 ℃；載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速為1.1 mL/min；溶劑延遲為3 min。

質譜條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為電子轟擊離子化；電子能量為70 V；全掃描質荷比范圍為m/z 50～550；采用選擇離子掃描模式進行定量，定量離子質荷比為m/z 131、m/z 103和m/z 77。

1.3.4 復合膜中肉桂醛的釋放性

1.3.4.1 復合膜中肉桂醛向異辛烷中的釋放

根據歐盟委員會指令EC 10/2011[20]，選擇向脂肪食品模擬物異辛烷進行遷移，采用100 mL的透明帶蓋玻璃瓶為遷移容器，按照100 mL食品模擬物對應60 cm2食品包裝材料進行遷移實驗。

將剪成5 cm×6 cm的復合膜樣品片浸沒在盛有50 mL異辛烷的玻璃瓶中，用封口鉗將蓋封緊，放入恒溫水浴鍋中，選取4、25、40 ℃作為遷移溫度，分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%肉桂醛的復合膜作為不同膜樣體積分數，選擇1、2、4、8、16、32、64、120、240 h為時間點進行取樣，以研究不同溫度、不同肉桂醛體積分數對遷移規律的影響。到達取樣時間時，將透明玻璃瓶從恒溫水浴鍋中取出，用微量加樣槍移取0.5 mL異辛烷，迅速將棕色玻璃瓶蓋緊并放回恒溫水浴鍋中，用一定比例的異辛烷稀釋，經0.22 μm有機濾膜過濾，上機測試。每個時間點重復3 次。

釋放率是異辛烷中測得的肉桂醛的質量濃度與復合膜中肉桂醛的初始含量的比值，釋放率公式如式（2）所示。

式中：ρ為某時間肉桂醛在異辛烷中的質量濃度/（mg/L）；V為對應肉桂醛質量濃度的異辛烷體積/L；k為檢測時所稀釋的倍數；C0為肉桂醛在殼聚糖膜中的初始含量/（mg/kg）；m代表殼聚糖膜的質量/kg。

1.3.4.2 復合膜中肉桂醛向空氣中的釋放

將剛制備好的復合膜分別剪成1 cm×5 cm的復合膜樣品片，精確稱量初始質量（精確到0.000 1 g）以及厚度（精確到0.01 mm），放入20 mL頂空瓶中，用封口鉗將蓋封緊，放置于4 ℃冰箱中（恒溫波動度為±0.5 ℃）和25、40 ℃（恒溫波動度為±2 ℃）恒溫烘箱中，以此作為復合膜中肉桂醛釋放溫度。預實驗表明肉桂醛向空氣中釋放較慢，所以選擇1、2、3、4、5、6、7、12 d為時間點進行取樣。在40 ℃、肉桂醛體積分數2.0%的條件下，肉桂醛的釋放規律較明顯，故本實驗探究40 ℃條件下4 種不同肉桂醛體積分數（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）對肉桂醛釋放的影響以及肉桂醛體積分數2.0%復合膜在4、25、40 ℃條件下的釋放規律。到達取樣時間時，將透明玻璃瓶從烘箱中取出，打開封口，頂空瓶一次一用，將復合膜用有機溶劑提取，經0.22 μm有機濾膜過濾，上機測試，經過與之前所測的初始質量相對比，得出差值即為肉桂醛在密閉頂空瓶空氣中所釋放的質量。每個時間點重復3 次。

復合膜中肉桂醛在空氣中的釋放率公式如式（3）。

式中：mF,0為復合膜中肉桂醛的初始質量/mg；mF,t為t時刻復合膜中肉桂醛的質量/mg。

1.3.5 復合膜在豬肉包裝上的應用

活性包裝材料中活性成分的釋放行為和規律對內裝食品的保鮮有重要作用。肉桂醛作為一種具有一定揮發性的活性成分，會同時向包裝外環境和內環境（包括向食品）遷移釋放，通過包裝設計，可以更好地利用其釋放規律延長食品保質期。本研究將其初步應用于生鮮肉的保鮮。

實驗用豬肉為從市場購得的里脊肉，保證距離屠宰時間不大于6 h。豬肉為去除可見結締組織以及皮下肌內脂肪的瘦肉，當天用。選取外觀均勻、較好的豬肉，分割成約10 g的小塊（厚度大約1 cm），用制備的膜包裹，分為3 組：空白組（肉樣無復合膜包裹）、CS組（純殼聚糖膜包裹）以及2.0% CIN-CS組（殼聚糖-肉桂醛復合膜包裹，V/V），所有肉樣外部用聚乙烯保鮮膜包裹后放置于密封袋中以隔絕外界環境的影響，置于4 ℃冰箱中冷藏。在第0、1、2、3、4、5、6、7、8天（第0天指購買當天）分別測定肉的pH值、揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、細菌總數，并進行感官評定。

1.3.5.1 TVB-N含量檢測

按GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》[21]檢測TVB-N含量，實驗重復3 次。根據GB 9959.1—2001《鮮、凍片豬肉》[22]，評定標準如下：新鮮肉為TVB-N含量不超過15 mg/100 g，次新肉為TVB-N含量不超過20 mg/100 g，變質肉為TVB-N含量大于20 mg/100 g。

1.3.5.2 pH值的測定

按照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》[23]進行，取待測鮮豬肉樣品10.0 g，絞碎，置于燒杯中，加蒸餾水至100 mL，用均質機均質10 min，靜置，用數顯式酸度計測液體的pH值，實驗重復3 次。評價標準：新鮮肉pH值為5.8～6.2，次鮮肉pH值為6.3～6.6，變質肉pH＞6.7。

1.3.5.3 細菌總數的分析

按照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[24]進行測定，所有微生物計數都表示為lg（CFU/g），實驗重復3 次，評定標準如下：新鮮肉細菌總數小于4 （lg（CFU/g）），次新鮮肉細菌總數為4～6 （lg（CFU/g）），變質肉細菌總數大于6 （lg（CFU/g））。

1.3.5.4 感官評價

根據Siripatrawan等[25]的方法適當修改，感官評定小組由10 名評價人員組成，通過感官評定觀察肉的色澤、氣味、黏液和整體的接受程度。感官評價設4 個指標、10 個水平：顏色（10為無變色；7為輕微變色；0為極不可接受）；氣味（10為非常可取；7為輕微的異味；0為極不可接受）；黏液形成（10為無黏液形成；7為輕微的黏液形成；0為非常不可接受）；整體的接受程度（10為非常可接受；7為輕微不可接受；0為極不可接受）。評分得分低于4定義為不可接受。所得評分去掉差異最大的數值，取幾何平均值，結果以雷達圖形式給出。

1.4 數據處理

實驗數據采用軟件SPSS 19.0進行方差分析，采用Duncan多重比較檢驗法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用軟件Origin Pro 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 熱重分析

由圖1可知，隨溫度的升高，添加了肉桂醛的復合膜在不同熱降解階段的質量損失都要少于純殼聚糖膜，并且隨肉桂醛體積分數的增加質量損失減少，說明肉桂醛的添加提高了各個組分物質的熱降解溫度，從而增強了復合膜的熱穩定性。

從圖1可以看到，隨溫度升高，復合膜與純殼聚糖膜的熱降解經歷階段有所差異，且質量變化率也有所不同。第一階段，發生在35～100 ℃，歸因于膜中基團水分子的蒸發以及甘油和低分子質量的蒸發化合物。第二階段為殼聚糖聚合物降解分解過程[26-27]，此階段分解最劇烈，發生在150～250 ℃，這期間樣品膜發生顯著的質量損失。據相關文獻所述，殼聚糖的疏水基團與肉桂醛的烷基鏈和苯環相互作用，并且隨肉桂醛體積分數和溫度的增加，降解殼聚糖乙酰基所需要的溫度提高，增強了熱穩定性[28]。第三階段為甘油的熱分解過程，大約在270～300 ℃間。第四階段（370～420 ℃）主要是肉桂醛的分解[29]，由于肉桂醛是有苯環的高度穩定芳香結構，導致其分解要在較高的溫度下進行。

2.2 肉桂醛的初始含量分析

經檢測，0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的肉桂醛-殼聚糖膜中肉桂醛的初始含量分別為（2.39±0.13）、（3.86±0.20）、（7.59±0.80）mg/kg和（18.93±1.78）mg/kg，不同肉桂醛體積分數實驗組間差異顯著。

2.3 溫度對復合膜中肉桂醛向空氣釋放行為的影響

圖2 溫度對2.0%CIN-CS復合膜中肉桂醛向空氣釋放行為的影響Fig. 2 Effect of temperature on release behavior of cinnamaldehyde from 2.0% CIN-CS antimicrobial films to headspace

如圖2所示，溫度對肉桂醛釋放速度有著重要的影響。隨著溫度的升高，肉桂醛的釋放量迅速增加，釋放率增大。一方面，溫度升高使得殼聚糖分子熱運動加快，分子鏈構象變化加快，聚合物內聚能下降，進而導致殼聚糖分子鏈間的空隙距離變大，因此溫度上升使其遷移速率加快；另一方面，由于肉桂醛具有高正辛醇/水分配系數，使它們有一定的擴散滲透能力，溫度上升，肉桂醛的活動能力增強，也使得釋放速度加快。釋放在第8天趨于平衡，40 ℃時的釋放率顯著大于25 ℃和4 ℃（P＜0.05），其中40 ℃環境下釋放率最高達59.22%，相比之下，25 ℃和4 ℃環境下釋放率只能達到28.95%～32.09%。

2.4 肉桂醛體積分數對復合膜中肉桂醛向空氣釋放行為的影響

不同肉桂醛體積分數復合膜中肉桂醛在40 ℃密閉環境下釋放行為如圖3所示。肉桂醛釋放率隨著膜中肉桂醛體積分數的升高而降低，0.5%、1.0%、1.5%的復合膜的釋放率大約平衡在84.45%～89.46%之間，而體積分數為2.0%的復合膜釋放率明顯小，在56.66%～59.22%之間。根據本課題組對復合膜X射線衍射已有的結論[19]及文獻[30]報道可知，肉桂醛濃度提高，膜表面結晶性加大，肉桂醛結晶程度也隨之增加，肉桂醛的晶體狀態對其釋放造成一定程度上的影響，所以高肉桂醛體積分數復合膜中肉桂醛的釋放率減小。

圖3 肉桂醛體積分數對復合膜中肉桂醛向空氣釋放行為的影響（40 ℃）Fig. 3 Effect of cinnamaldehyde concentration on release behavior of cinnamaldehyde from antimicrobial films to headspace at 40 ℃

2.5 復合膜中肉桂醛向異辛烷中釋放行為的分析

圖4 復合膜中肉桂醛向異辛烷中的釋放行為Fig. 4 Release behavior of cinnamaldehyde from antimicrobial films to isooctane

結合圖4可知，隨溫度的升高，復合膜中肉桂醛的釋放率各有不同程度的增加。隨著溫度的升高，肉桂醛更加容易釋放，根據自由體積理論[31]，溫度越高，原子熱活化能量越大，越容易發生擴散行為。在各溫度下，不同肉桂醛體積分數的復合膜中肉桂醛的釋放率大小順序為：0.5%復合膜＞1.0%復合膜＞1.5%復合膜＞2.0%復合膜，可能是高體積分數復合膜中肉桂醛分子的結晶程度高，對其釋放造成了一定程度上的影響[32]。各體積分數復合膜釋放率最大達81.76%，最終均不能達到100%，可能是由于異辛烷對肉桂醛溶解度有影響；另一方面，也與肉桂醛在膜與溶液中的含量差有關。當兩相含量接近時，肉桂醛的滲透性減小，釋放率趨于平衡。同時，在0～32 h內，即釋放初始階段，不同溫度下各體積分數膜的釋放率變化都最大，這主要與溶液兩相間物質的含量差有關。除此之外，溫度越高，釋放速率越大，達到平衡所需時間越短。

2.6 TVB-N含量分析

肉類主要成分為蛋白質、脂肪和碳水化合物，其容易在細菌的作用下被分解并逐漸產生一些有毒的物質，在豬肉貯藏過程中，這些物質和其他堿性氮化物一起組成TVB-N，TVB-N是一個評估豬肉新鮮程度的重要指標[33]。如圖5所示，空白組的TVB-N含量迅速上升，到第5天變質。而與空白組相比，殼聚糖對肉中微生物生長起到了一定的抑制作用，而肉桂醛能更好地抑制腐敗菌，抑制微生物分泌的蛋白酶和一些組織蛋白酶，從而減少了TVB-N的產生。從TVB-N含量看，相比于空白組，CS組和2.0% CIN-CS組保鮮時間分別延長了1 d和3 d。

圖5 鮮豬肉在4 ℃貯藏環境下TVB-N含量的變化Fig. 5 Change of TVB-N in fresh pork at 4 ℃

2.7 pH值分析

貯藏過程中空白組pH值均高于CS組和2.0% CIN-CS組（P＜0.05）。豬肉屠宰后，組織的呼吸由有氧呼吸變為無氧呼吸。無氧呼吸過程中肌糖原無氧糖酵解產生乳酸，三磷酸腺苷分解產生磷酸，兩酸共同作用下，導致pH值在剛開始會有一個下降的過程。而后，隨時間的延長，由于豬肉中微生物蛋白酶和豬肉蛋白酶的分泌，冷鮮肉蛋白質分解為氨基酸和肽，氨基酸和肽進一步分解為氨和胺從而導致pH值逐漸增加[34-35]。空白組pH值上升較快，第5天時pH值已達到6.68，接近變質。CS組和2.0% CIN-CS組對豬肉腐敗有一定的控制作用，豬肉的pH值分別在第6天和第8天達到變質。

圖6 鮮豬肉在4 ℃貯藏環境下pH值的變化Fig. 6 Change in pH of fresh pork at 4 ℃

2.8 細菌總數分析

圖7 鮮豬肉在4 ℃貯藏環境下細菌總數的變化Fig. 7 Changes in total bacterial counts of fresh pork at 4 ℃

由圖7可知，空白組的豬肉在第3天細菌總數超過4 （lg（CFU/g）），屬于次鮮肉，第5天的細菌總數超過6 （lg（CFU/g）），已腐敗變質。CS組中細菌的生長有一定程度的抑制，在第6天時細菌總數接近變質。2.0% CIN-CS組在第4天時仍處于新鮮肉范圍內，第5～7天屬次新鮮肉。

2.9 感官評價

豬肉在貯藏時期顏色的變化主要是微生物生長和脂質氧化所致。各組顏色評分隨貯藏時間延長而下降（圖8a），空白組顏色得分均顯著低于CS組和2% CIN-CS組（P＜0.05），在第6天達到不能接受的分數（感官評分為3.5）。對于2.0% CIN-CS組的豬肉，顏色評分在整個貯藏期內均可以接受，說明肉桂醛對于抑制微生物生長和脂質氧化有一定作用。

肉具有微生物生長的營養條件，容易滋生微生物，并且易被氧化，微生物的生長和脂肪氧化是造成肉腐敗酸臭味的主要原因[36]。各組的氣味評分隨貯藏時間的延長而減小（圖8b），空白組的氣味評分在第4天接近不可接受范圍，在第8天，除了2.0% CIN-CS組外，其他兩組都在不可接受范圍，說明肉桂醛具有一定的抗菌以及抗氧化作用，抑制豬肉腐敗酸臭味作用明顯。

黏液的產生主要是因為酵母菌和霉菌的繁殖所致[37]，肉在貯存過程中如果發生腐敗則表面會變黏，黏液產生量越多，變質越嚴重。如圖8c，空白組黏液形成多于其他兩組（P＜0.05），到第6天處于不可接受范圍。其他兩組的黏度在整個貯藏期都保持良好，這與真菌對肉桂醛的高敏感性有關。另外，殼聚糖膜有一定的吸附水分作用，使得豬肉的水分含量減少，黏度下降，有利于減少細菌的繁殖。

整體感官接受程度如圖8d所示，空白組的感官評價最低，而包裹復合膜的豬肉的感官品質整個貯藏期都可以被接受，復合膜對提高豬肉抗菌性以及抗氧化活性有一定作用，具有維持豬肉感官質量和延長保質期的作用。

圖8 4 ℃貯藏環境下鮮豬肉的感官評價Fig. 8 Sensory evaluation of fresh pork at 4 ℃

3 結 論

本研究制備了一種具備一定力學性能以及抑菌性的可降解活性復合膜。分別探討了該復合膜的熱穩定性、在頂空密閉環境和異辛烷中活性成分肉桂醛的釋放規律，初步研究了4 ℃冷藏條件下其包裝生鮮豬肉的保鮮效果。得出以下結論：肉桂醛體積分數的增加促進了復合膜熱穩定性的提升；肉桂醛的釋放率受肉桂醛體積分數和溫度影響，肉桂醛體積分數越高，其在復合膜中向空氣和異辛烷的釋放率越小，溫度上升會提高復合膜中肉桂醛的釋放率；對冷藏鮮豬肉的活性包裝實驗表明，肉桂醛體積分數為2.0%的復合膜在抑制微生物生長和蛋白腐敗方面取得了良好的效果，肉樣的貯藏時間可達7 d。

綜上所述，肉桂醛-殼聚糖復合膜的釋放性對豬肉保鮮具有良好的效果，可進行后續關于活性物質的釋放對食品保鮮的研究，并進一步開發和優化活性包裝體系。

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