采后苯丙噻重氮處理促進梨果實的愈傷

張靜榮，王 斌，姜 紅，王 毅，李 雪，司 敏，李永才，畢 陽*

梨是溫帶地區的重要水果，但梨果實在采收及采后各環節中易遭受機械損傷，果實表面形成的傷口為病原物的侵染提供了通道，導致采后病害發生[1]。多種真菌與梨果實的采后病害相關，其中由互隔交鏈孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病是我國北方梨果實的最常見病害[2]。有報道表明，果蔬具備采后愈傷的能力，通過自我激活一系列的防御代謝來促進傷口愈合，從而有效抑制水分蒸騰，阻止病原菌的侵入[3]。但正常的自然愈傷所需時間偏長，因此有效縮短梨果實愈傷時間是當前生產中亟待解決的問題。Spotts等[4]發現，‘d’Anjou’和‘Bosc’兩品種西洋梨果實在20 ℃下愈傷2 d后，再在傷口處接種灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和擴展青霉（Penicillium expansum），灰霉病和青霉病的發病率明顯降低；對傷口處組織觀察發現，有纖維素、軟木脂及單寧等愈傷成分的積累。同樣，蘋果果實分別在20 ℃和38 ℃下愈傷4 d后，再在傷口處接種B. cinerea和P. expansum后，發現熱處理下灰霉病和青霉病的發病率顯著降低，傷口處組織有明顯的酚類及木質素等愈傷成分沉積[5]。苯丙噻重氮（benzothiadiazole，BTH）是一種人工合成的水楊酸類似物，可誘導多種果蔬的采后抗病性[6]。BTH采后處理可以誘導鴨梨果實對P. expansum的抗性[7]，還可增強蘋果果實的采后抗病性[8]。BTH誘導果實抗性的機理主要與激活苯丙烷代謝、促進活性氧代謝，以及表達病程蛋白基因有關[9]。雖然已有仁果類果實愈傷以及BTH誘導仁果類果實采后抗病性的報道。但鮮見BTH處理對仁果類果實采后愈傷能力影響的報道。本實驗以‘玉露香’梨為原料，人工模擬損傷后用100 g/L BTH處理傷口，在常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%條件下進行愈傷，通過觀察果實質量損失率和損傷接種A. alternata后的發病率以及測定愈傷期間傷口處組織苯丙烷代謝關鍵酶和產物的積累，以及抗氧化酶的活力變化，通過比較處理組和對照組之間的差異來評價愈傷效果，為BTH誘導梨果實的快速愈傷提供理論和方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘玉露香’梨于2015年10月采自甘肅省景泰縣國營條山集團梨生產基地，選取外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，單果套網套后入瓦楞紙包裝箱，于當天運抵甘肅農業大學食品學院采后生物學與技術實驗室，于常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%條件下貯藏待用。供試A. alternata由甘肅農業大學采后生物學與技術實驗室提供，PDA培養基中培養并保存待用。

BTH（有效體積分數50%） 北京Solarbio公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學顯微鏡 奧林巴斯工業有限公司；UV2450型島津分析儀器 日本島津公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；1510-04087型酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梨果實人工損傷、BTH處理及愈傷

參考Fu Da等[10]的方法并作修改。梨果實先用清水沖洗，然后用體積分數1%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min進行表面消毒，無菌水沖洗、晾干后，用滅菌接種釘在梨果實的赤道部位均勻刺出3 個深3 mm、直徑3 mm的傷口。0.5 h后將損傷的梨果實浸入100 g/L BTH中5 min，取出晾干后分別裝入打孔的聚乙烯保鮮袋（25 cm×40 cm，厚0.02 mm），于常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%的黑暗條件下進行愈傷。以清水處理作對照。每處理用梨果實100 個，重復3 次。1.3.2 愈傷效果的評價

1.3.2.1 質量損失率的測定

參照曹建康等[11]的方法。采用質量法測定愈傷期間梨果實的質量損失率。每個處理用梨果實15 個，重復3 次。

1.3.2.2 發病率的測定

參照Li Yongcai等[12]的方法。于培養7 d的A. alternata培養皿中加入適量的無菌水，用涂布器刮下培養基表面的孢子，用4 層紗布過濾至三角瓶中，振蕩20 s，采用血球計數板計數，制備成濃度為1×106CFU/mL的孢子懸浮液。在梨果實愈傷的第0、0.5、1、2、4、6天，將已配制好的20 μL孢子懸浮液注入梨果實人工損傷的傷口處，接種梨果實重新裝入打孔聚乙烯保鮮袋中，于常溫黑暗條件下愈傷，4 d后統計損傷接種梨果實的發病率，表皮出現黑斑且病斑直徑超過3 mm計作病果。每個處理用梨果實15 個，重復3 次。

1.3.3 生化測定樣品取樣

在愈傷后的第0、0.5、1、2、4、6天時，采用手術刀切取創口周邊5 mm、深3 mm的愈傷組織3 g，錫箔紙包好后液氮冷凍，在-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3.4 PAL、SOD、POD、PPO活力及蛋白質含量的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的測定參照葛永紅等[13]方法。取冷凍組織3 g，用3 mL 0.05 mol/L的硼酸緩沖液（含1 g/100 mL聚乙烯聚吡咯烷酮（poly-vinylpolypyrrolidone，PVPP）、5 mmol/L?β-琉基乙醇，pH 8.8）冰浴研磨成勻漿，4 ℃、15 000×g離心30 min，取上清液用于酶活力的測定。反應體系：在500 μL粗酶液中加入0.05 mol/L的硼酸緩沖液中（pH 8.8），再加入20 mmol/L的L-苯丙氨酸，37 ℃保溫30 min，充分混合后于290 nm波長處測定吸光度，作為反應初始值（A0）。再在37 ℃下反應60 min，測定其吸光度（A1）。對照組以硼酸緩沖液代替酶液。以每分鐘內吸光度變化0.01為1 個活力單位（U），酶活力單位為U/mg。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定參照Venisse等[14]方法。取3.0 g冷凍組織，加入3 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.5，含5 mmol/L二硫蘇糖醇和2 g/100 mL PVPP），冰浴條件下研磨成勻漿后于4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液立即用于酶活力測定。取5 mL指形管4 支，2 支為測定管，另2 支為對照管，依次加入1.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mmol/L甲硫氨酸溶液、0.3 mL 750 μmol/L氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）溶液、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-2Na溶液、0.3 mL粗酶液，最后加入0.3 mL 20 μmol/L核黃素。其中對照組的2 支管以緩沖液代替酶液，混勻后將1 支對照管置于暗處，其他各管于4 000 Lux日光燈下反應15 min。至反應結束后，以暗處對照作空白參比，于560 nm波長處分別測定其他各管的吸光度。以每毫克蛋白抑制NBT光化還原的50%為一個酶活力單位（U/mg）。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照Bradford[15]方法。取冷凍組織3 g，加入5 mL 4 ℃預冷的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 5.9，含0.5 g/100 mL PVPP），冰浴下充分研磨成勻漿，在4 ℃ 11 250 r/min下離心20 min，上清液立即用于POD活力測定。反應體系包括：2.5 mL 25 mmol/L愈創木酚、200 μL 250 mmol/L H2O2和200 μL上清液，加入上清液15 s后用酶標儀開始記錄反映體系在470 nm波長處的吸光度變化，連續測定2 min，以每分鐘吸光度變化0.01為一個POD活力單位（U），酶活力單位為U/mg。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參照Li Yongcai等[12]的方法。取冷凍組織3 g，加入3 mL pH 7.5的50 mmol/L的磷酸提取緩沖液（內含4 g/100mL PVPP、1 mmon/L聚乙二醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、體積分數0.01 % Triton X-100），冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、15 000×g離心20 min，取上清液為粗酶液。反應體系包括：2 mL pH 7.5的磷酸緩沖液、100 μL粗酶提取液。空白組不加酶液，其余同反應體系。以每分鐘內吸光度變化0.01為1 個活力單位（U），酶活力單位為U/mg。

1.3.5 木質素、總酚及類黃酮含量的測定

木質素含量的測定參照Yin Yan等[16]方法。取冷凍組織3 g，在預冷的5 mL 、體積分數95%乙醇溶液中研磨成勻漿狀，然后4 ℃、14 000×g離心30 min，棄去上清液，將沉淀物用體積分數95%乙醇溶液沖洗3 次，再用乙醇-正己烷（1∶2，V/V）溶液沖洗3 次，再次收集沉淀在60 ℃烘箱中干燥24 h，將干燥物轉移至離心管中，溶于1 mL溴化乙酰-冰醋酸（1∶4，V/V）溶液，70 ℃恒溫水浴30 min，最后加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸溶液，離心，取上清液0.5 mL，用冰醋酸定容至5 mL，在280 nm波長處測定吸光度，重復3 次。木質素含量以A280nm表征，以鮮質量計。

總酚及類黃酮含量的測定參照Yin Yan等[16]方法。取冷凍組織3 g，于預冷的 5 mL體積分數1%鹽酸-甲醇溶液中，冰浴研磨成勻漿，然后于4 ℃下12 000×g離心30 min，收集上清液分別于280、325 nm波長處測定吸光度。總酚與類黃酮含量分別以A280nm和A325nm表征，以鮮質量計。

上述各項測定均做3 次重復。

1.4 數據統計與分析

全部數據用Excel 2007軟件計算平均值和標準差，用SPSS 19.0進行Duncan’s多重差異顯著性分析及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 BTH處理對梨果實愈傷期間質量損失率和發病率的影響

圖1 BTH處理對愈傷期間梨果實質量損失率（A）和發病率（B）的影響Fig. 1 Effect of BTH treatment on weight loss rate (A) and decay incidence (B) of pear fruits during wound healing

由圖1可知，愈傷期間，對照組和BHT處理組果實的質量損失率均逐漸升高，雖然BHT處理組果實的質量損失率始終低于對照組，但無顯著差異。對照組和BHT處理組果實的發病率隨愈傷時間的延長而逐漸降低，但BTH處理組果實的發病率明顯低于對照組，第4天時，BTH處理組果實的發病率僅為對照組的40%，第6天時，處理組果實的發病率已降至13%，而對照組果實的發病率仍高達34%（圖1B）。

2.2 BTH處理對愈傷期間梨果實PAL、SOD、POD、PPO活力的影響

圖2 BTH處理對梨果實愈傷期間PAL（A）、SOD（B）、POD（C）及PPO（D）活力的影響Fig. 2 Effect of BTH treatment on PAL (A), SOD (B), POD(C) and PPO (D) activities in pear fruits during wound healing

由圖2A可知，愈傷期間，對照組梨果實的PAL活力除在第4天稍有升高外，其他時間基本保持平穩。而BTH處理組梨果實的PAL活力在0.5 d內快速升高，之后保持平穩，4 d之后又開始上升。BTH處理組梨果實的PAL活力在愈傷期間始終明顯高于對照組，且在第0.5天和第6天時，分別高于同期對照組1.29 倍和2.16 倍。對照組梨果實的SOD的活力則整體呈降低趨勢，處理組梨果實的SOD活力在愈傷期間先升高后降低(圖2B)，處理組梨果實的SOD活力始終高于對照組，在第0.5天和第6天時，分別高出同期對照組50%和2.8 倍。處理組梨果實的POD活力在愈傷期間逐漸升高，對照組果實則是先降低后升高(圖2C)，愈傷1 d后處理組果實的POD活力始終高于對照組，第1天和6天時，分別高出同期對照組2.5 倍和1.3 倍。處理組梨果實中的PPO活力在愈傷期間總體呈升高的趨勢，對照組梨果實則出現先升高后降低再升高的趨勢（圖3D），處理組梨果實的PPO活力始終高于對照組，在第1天和第6天時，分別高出同期對照組6.4 倍和3.1 倍。

2.3 BTH處理對梨果實愈傷期間的總酚、類黃酮和木質素含量的影響

總酚含量先上升后維持穩定，處理組梨果實的總酚含量在0.5 d后整體高于對照組，第1天和第6天時，分別比同期對照組高19.0%和19.8%（圖3A）。愈傷前期處理組和對照組梨果實中的類黃酮含量均迅速升高，0.5 d后對照組梨果實的類黃酮含量開始下降并保持平穩，處理組梨果實則持續上升，且至第4天達到峰值，第1天和第4天時，處理組梨果實的類黃酮含量分別高于同期對照組63%和94%(圖3B)。對照組梨果實的木質素含量在愈傷后期則基本保持穩定，處理組梨果實的木質素含量在愈傷前期迅速升高后保持平穩，至第4天達到峰值，處理組梨果實的含量始終高于對照組(圖3C)，在第0.5天和第4天時，分別高出同期對照組1.4 倍和75%。

圖3 BTH處理對梨果實愈傷期間總酚（A）、類黃酮（B）和木質素（C）含量的影響Fig. 3 Effect of BTH treatment on the contents of total phenols (A),flavonoids (B) and lignin (C) in pear fruits during wound healing

2.4 BTH處理后梨果實發病率和相關指標的相關性

表1 BTH處理后梨果實發病率和相關指標的相關性分析Table 1 Correlation between BTH treatment and related parameters of pear fruits

由表1可見，處理梨果實的發病率和PAL活力、總酚含量、類黃酮含量之間均呈顯著負相關，相關系數分別為0.538、0.496、0.502。由此表明，BTH處理通過提高PAL活力激活了苯丙烷代謝，從而促進了梨果實愈傷，且抑菌物質總酚、類黃酮在抑制梨果實發病率方面起到了重要的作用。處理組梨果實的發病率與POD和PPO活力之間呈極顯著負相關，相關系數分別是0.594、0.638。由此表明，POD及PPO在促進愈傷物質聚合及形成抗菌物質方面發揮了重要作用。

3 討 論

作為水楊酸的類似物，BTH可誘導多種果蔬的采后抗病性[6]。本研究發現，BTH可通過活化苯丙烷代謝關鍵酶PAL，促進代謝產物總酚、類黃酮和木質素的積累，提高POD和PPO的活力來促進梨果實的愈傷和降低采后病害的發生。

苯丙烷代謝在植物愈傷中具有重要作用[17-18]。PAL是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸[19]，傷口部位PAL的活力提高可促進酚類物質的積累，酚類物質不僅可抑制病原菌通過傷口侵染果實[20]，又可參與愈傷組織的形成，抵御病原菌的侵入[21-22]。酚類物質是合成木質素的前體，木質素是由肉桂醇、咖啡醇和芥子醇等木質素單體聚合而成的致密復合物，是構成愈傷組織的主要成分，總酚和木質素含量的增加可促進傷口修復。此外，愈傷還會誘導細胞分化形成特定的愈傷組織，從而使健康組織與受損位部位隔離，形成抵御外界病原物侵染的物理屏障[23-24]。類黃酮則是重要的植保素，在抑制病原物的擴展中發揮了重要作用，類黃酮的產生速率和積累量常作為植物抗病性強弱的重要指標[25]。本研究中發現的BTH處理提高了梨傷口組織中苯丙烷代謝關鍵酶活力的結果與前人采用BTH誘導鴨梨果實采后抗病性提高的結果[7]基本一致。

SOD是生物體內唯一可以清除超氧陰離子的酶，可將超氧陰離子歧化為H2O2，而H2O2則參與了愈傷組織形成中細胞壁成分的氧化交聯，通過氧化交聯才可在傷口表面形成一層物理屏障，從而阻止水分的蒸發和防止病原物的侵入[26]。本研究中，BTH處理誘導了SOD活力的升高，增強其抗病性，該結果與Sparla等[27]采用水楊酸處理增強梨果實SOD活力的結果基本一致。PPO是廣泛存在于植物體內的氧化酶類，能催化多酚類物質氧化為醌類化合物[28]，醌對病原菌具有很高的毒性，可直接抑制病原菌的生長[29]。POD既是重要的抗氧化酶類，也是催化木質素單體聚合形成木質素的關鍵酶，在愈傷組織的形成中具有關鍵作用。傷口部位POD的活力與愈傷組織的形成之間密切相關[30]。本研究中發現的BTH處理誘導了梨果實POD活力升高的結果與前人采用BTH誘導蘋果果實POD活力升高的結果[8]基本一致。

4 結 論

采后BTH處理可顯著促進梨果實的愈傷和降低采后病害的發生。該作用機理與激活苯丙烷代謝關鍵酶PAL活力，提高代謝產物總酚、類黃酮和木質素的含量密切相關。此外，BTH處理還提高了SOD、POD和PPO 3 種抗氧化酶的活力，這些酶活力的提高與H2O2供應、細胞壁成分的氧化交聯和抗菌物質的積累密切相關。

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