肉雞大腸桿菌的分離鑒定

文│曹民川 周麗梅 唐振興（陜西省銅川市動物疫病預防控制中心）

本研究以陜西省銅川市某養殖場疑似肉雞大腸桿菌病的病雞為研究對象，采集其肝臟、脾臟等組織作為病料，進行細菌的分離培養以及生化鑒定、血清型鑒定，并進一步進行了藥敏試驗。試驗結果表明，分離獲取的40株分離株均為大腸桿菌，分離率為66.67%，其血清型分別為O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株）。藥敏試驗結果顯示：分離株對環丙沙星高敏；對卡那霉素、紅霉素中敏；對青霉素、鏈霉素、慶大霉素低敏。因此，環丙沙星可以作為該養雞場預防和治療雞大腸桿菌病的藥物，其他抗生素可以減少其使用量或停用。

當機體的抵抗力下降或者外界的環境發生改變有一部分大腸桿菌成為致病菌株，達到了致病性大腸桿菌生長發育的條件，大腸桿菌數量增多，就會乘虛而入侵入動物腸道內并在合適的位置定居，生長繁殖。臨床上以出現心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、眼球炎及肉芽腫、敗血癥等為特征。大腸桿菌可以通過飼料、水、空氣等進行傳播，也可以垂直傳播但容易造成死胚、弱雛增多，使養禽業受到打擊。大腸桿菌病是養雞業最嚴重的常見多發病，尤其是3～6周齡的雛雞容易感染，且在臨床中多以混合感染，從而難以治愈，發病率高，死亡率逐步增加。該病的傳染性強，傳播范圍廣，因為大腸桿菌的血清型比較復雜，目前沒有有效的疫苗可以預防。因此，該病一直以來主要用藥物來進行防治，這使得耐藥性越來越嚴重，給治療帶來一定的難度。

大腸桿菌生長的環境簡單，營養的要求低，在一般的營養培養基上即可成長，溫度在15～45℃，菌落直徑2～3毫米，圓形，表面濕潤光滑。該菌對理化要素較敏感，60℃25分鐘或55℃1小時即可致死，121℃經高壓滅菌迅速死亡。該菌對自然因素抵抗力較強，可在水中生存百余天，在糞便中能生存200多天，在飼料、墊草，中也可長期生存。大腸桿菌對甲醛、漂白粉敏感，但是如果存在糞便以及黏液，會很大一部分降低這些消毒劑的成效。多數禽類對大腸桿菌較為敏感，并且在感染后病情會加重，雛雞極易發生氣囊炎。感染大腸桿菌的肉雞表現精神萎靡，體溫呈上升趨勢，食欲減少，消瘦和下痢，全身無力，羽毛變得疏松，呆立，伸頸閉眼，行動緩慢，其中糞便里混有少量黏液，經常導致肛門周圍的羽毛受到污染。情況嚴重的病雞腹部出現高度腫大，觸摸敏感并伴有波動，病程能夠持續兩個星期或更長。

治療大腸桿菌病首先應該改善飼養環境，及時清除雞糞，提高室溫，改善雞舍通風的狀況，利用百毒殺每天帶雞噴霧消毒2次，連續使用7天。可使用硫酸卡那霉素，按70毫克/千克體重的用量，2次/日，肌肉注射，連續使用3天，用藥2天后雞群采食量增加，癥狀開始出現好轉，5天后雞群開始恢復正常。

本研究對疑似肉雞大腸桿菌病的病雞采集其肝臟、脾臟作為病料，進行細菌的分離培養、血清型鑒定、藥敏試驗，為臨床治療肉雞大腸桿菌病提供了參考。

一、材料與方法

1.材料。

（1）病料。取自銅川市某養殖場中疑似患有大腸桿菌病的病雞，60只，3～6周齡。

（2）培養基。肉湯培養基，麥康凱培養基，普通瓊脂培養基。

（3）標準O型分型血清。單因子大腸桿菌血清（購自中國獸醫藥品監察所）。

（4）主要儀器和設備。恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）、高壓蒸汽滅菌鍋（山東新華醫療機械有限公司）、光學顯微鏡（奧林巴斯、濟南）。

2.方法。

（1）臨床檢查。觀察病雞的精神狀態、飲欲、食欲和雞的羽毛色澤，用手觸摸，給予適當的刺激觀察雞的反應。觀察病雞產蛋的情況、排泄物的黏稠程度，糞便顏色，有沒有惡臭，并且查閱最近兩周內雞群的采食量的記錄。

（2）剖檢。首先仔細觀察病雞的表面狀況，包括雞冠和皮膚、鼻腔和嘴的分泌物及排泄物的性狀、顏色，然后打開胸腔、腹腔，觀察有無積液，觀察黏膜、氣囊的變化，各內臟器官有無出血等病變，并無菌采集病死雞的肝臟、脾臟作為病料。

（3）病原菌的分離培養與純化。在無菌條件下取病雞的肝組織，脾臟組織等接種于肉湯培養基、普通瓊脂培養基和麥康凱瓊脂平板培養基，37℃恒溫的培養箱培養23～24小時，觀察結果。

（4）生化試驗。選取麥康凱培養基上單一紅色菌落于營養肉湯中，37℃培養17小時后，取適量的菌液，分別接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘露醇、山梨醇、硫化氫、肌醇、尿素、V.P試驗，37℃培養24～48小時，觀察結果。

（5）血清型鑒定?？乖闹苽?。制備高壓抗原：在普通的瓊脂斜面平板上以及供大腸桿菌生長的肉湯小管里接種來自麥康凱培養基上接種被檢的菌株，其中被檢菌株放在37℃恒溫培養箱中，培養24小時，在麥康凱培養基上形成典型的、單個的小紅色菌落，進行分別接種，接種后在37℃恒溫培養箱連續培養24小時，其中普通肉湯小管為液體培養基，在培養期間需要震蕩。然后用約3毫升的0.5%石碳酸生理鹽水沖洗瓊脂斜面培養物，放置試管中，并與普通肉湯小管培養物一起放到121℃高壓中2小時，破壞K抗原。

玻板凝集反應。將高壓抗原和血清分別取8毫升放到玻板上混合均勻，在2～4分鐘內呈現明顯的凝集則為陽性反應。

（6）藥敏試驗。打開超凈工作臺，點燃酒精燈，將接種環在酒精燈上來回灼燒進行滅菌，然后挑取細菌培養物，將菌液均勻的涂布到平皿中。然后用無菌的鑷子夾起藥敏紙片放到固體培養基上面并輕輕按壓，使藥敏紙片與培養基表面全部接觸。為了能夠精確察看結果，藥敏紙片位置安放適中，避免出現抑菌圈重疊。20分鐘后再置于37℃溫箱中培養18～24小時，觀察結果。

二、結果

1.臨床檢查結果。病雞精神萎靡，咳嗽，呼吸困難，羽毛疏松，飲欲變大，食欲減小，用手觸摸，能感受到病雞畏寒發抖，給予適當的刺激，病雞反應停滯；產蛋率下降，蛋小、蛋殼粗糙；排黃綠色的稀糞，有酸臭味。

表1 分離細菌生化試驗結果

◎圖1 分離菌菌落形態（營養瓊脂培養基）

◎圖2 分離菌菌落形態（麥康凱培養基）

2.剖檢變化。病雞的雞冠出現暗紫色，皮膚外表顏色暗淡、無光澤，鼻分泌物增加；解剖病雞可見腹腔內有大量的腹水；直腸腸管的黏膜以及泄殖腔黏膜呈現彌漫性的針尖狀出血，氣囊變厚，出現混濁；肝臟變得腫大，外表籠罩一層點狀黃白色纖維性膜，表面有大小不等的壞死斑。

表2 40株分離菌血清型鑒定結果

表3 大腸桿菌藥敏試驗結果

3.病原菌的分離與純化。待分離菌在營養瓊脂培養基上生長24小時后，形成乳白色菌落，在麥康凱培養基上形成紅色菌落，如圖1、圖2。分離菌經過涂片、染色、鏡檢，形成革蘭染色陰性短粗桿菌無可見的莢膜，具有典型的大腸桿菌的染色特及形態，如圖3。

4.生化試驗結果。從分離培養的細菌中，挑取典型的菌落，使用馬丁湯培養，用常規方法進行生化試驗，結果見表1。

5.血清型鑒定結果。對銅川市某養殖場送檢的60份病料，經鑒別分離出40株肉雞源大腸桿菌菌株，分離率為66.67 %。其中40株肉雞源大腸桿菌中有33株鑒定出O血清型，占分離菌株的82.50 %；7株未定型，占分離菌株的17.50%。鑒定出的33株大腸桿菌O血清型分別為O78（10株）、O2（8株）、O8（6株）、O143（4株）、O1（3株）、O35（2株），其中主要的血清型為O78、O2、O8三種，占分離菌株總數的72.73 %，結果見表2。

6.藥敏試驗結果。結果顯示，環丙沙星對大腸桿菌的敏感性較高；卡那霉素、紅霉素對大腸桿菌的敏感性一般；青霉素、鏈霉素、慶大霉素對大腸桿菌的敏感性較低；說明環丙沙星作為治療該病首選藥物。具體結果見表3。

三、討論

本研究通過對銅川市的40株肉雞源致病性大腸桿菌分離菌株的血清型鑒定結果可以知道O78、O2、O8等菌株出現的頻率很高，這與國內外研究報道的O78和O35禽致病性大腸桿菌常見血清型基本相符。

本研究分離鑒定出40株肉雞源大腸桿菌菌株，分離率為66.67%，分離率較高，表明大腸桿菌病在該地區發生頻繁，是養殖業中常見病之一。通過分析我們可以知道，該病的發生與多種因素有關，如飼養管理不當、營養失衡、疫苗接種所產生的應激、天氣惡劣或繼發于其他的疾病等。該病多以混合感染的形式出現，大腸桿菌病產生的概率也越來越高，治療也越來越困難，目前大腸桿菌病已居于細菌性疾病之首?，F在，如果只是單一防治大腸桿菌病已經難以收到理想的效果，與此同時應該消除其他可能性的致病因素。在已經出現耐藥性的雞場尤其是高發地區，最好能進行大腸桿菌的藥敏試驗，篩選出高敏藥物，制訂出合理的給藥計劃，配合環境消毒，改善飼養管理的條件，從而達到理想的治療效果。

目前養殖業發展速度非常快，細菌的耐藥性問題也越來越受到人們的關注。林居純等2009年對來自我國不同地區的588株大腸桿菌進行耐藥性檢測，結果顯示禽源大腸桿菌的多重耐藥性現象非常嚴重，禽源菌株占95.12%。

◎圖3 分離菌在顯微鏡下的形態（×100）

隨著大腸桿菌耐藥菌株不斷增加，肉雞大腸桿菌病的有效防治也越來越難，嚴重危害畜牧業健康發展。細菌的耐藥性是可以通過質粒的接合、轉導、轉化在細菌間轉移擴散，威脅人類的身體健康。因此，我們需要尋找有效、能夠延緩和減少細菌耐藥性產生的治療方法。首先，我們應該學會科學適當的養殖、防止過度濫用藥物；條件好的養殖場應該通過藥敏試驗來選擇用藥；優化飼養管理的方式，減少大腸桿菌病的發生。