外周血T細胞對HBV-SACLF預測作用的研究*

張志鋒，孫業富，夏愛萍（.揚州市職業大學醫學院，江蘇5009；.高郵市人民醫院消化內科，江蘇5600）

肝衰竭患者救治困難，病死率高，其早期病死率達30%，而中、晚期的短期病死率更高，可達50%以上。由于內科治療效果往往不佳，肝臟移植是目前唯一有效的治療方法[1-3]。因此，及時、準確地對肝衰竭的發生進行預測并采取恰當的手段及時治療，將提高患者的生命質量。目前，人們對于輔助性 T細胞（Th）22、Th17、Th1在乙型肝炎病毒（HBV）相關肝臟疾病中的作用已有不同程度的了解[4-6]，但對于其與HBV-慢加亞急性肝衰竭（HBV-SACLF）的關系、預測HBV-SACLF的發生及對病情嚴重性和進展判斷方面的作用所知甚少。本研究通過檢測HBV-SACLF患者外周血Th22、Th1、Th17細胞水平，初步分析Th22、Th1、Th17細胞在HBVSACLF中的作用及三者之間的關系?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年3月至2016年2月在高郵市人民醫院住院的普通乙型肝炎患者30例（乙型肝炎組）、HBV-SACLF患者39例（HBV-SACLF組）及體檢健康人群30例（健康對照組）作為研究對象。按照患者的病情及住院期間狀態，將39例HBV-SACLF患者分為早期15例、中期15例和晚期9例三組。以2015版的《慢性乙型肝炎防治指南》及2012版《肝衰竭診療指南》作為診斷標準[7-8]；所選患者全部排除其他病原體感染，以及排除自身免疫性疾病、酒精性肝病、原發性肝癌等；所選患者未含產婦、哺乳期婦女及合并有如心臟病等其他嚴重疾病患者。所有試驗對象或者家屬都簽署知情同意書。各組在年齡、性別構成方面比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），HBV-SACLF組谷丙轉氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、清蛋白（ALB）、HBV-DNA 及終末期肝模型（MELD）評分與乙型肝炎組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組一般資料比較

1.2 方法 Th22、Th17、Th1細胞檢測 從肘靜脈采取空腹血標本100 μL，加入等體積的1640培養液充分混勻，再加入 PMA（50 ng/mL）、離子霉素（50 μg/mL）、莫能霉素（0.1 μg/mL）后，在 37℃、5%CO2孵箱中孵育5 h，收集細胞，經磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌后，加入CD4-FITC、CD8-APC、CD3-PE-CY7 抗體，輕輕振蕩混勻，4℃避光孵育30 min。經細胞表面標記后，每管加入1 mL Fixation/Permeabilization工作液，輕輕振蕩混勻，4℃避光孵育30 min。離心5 min，棄去上清液，振蕩重懸細胞。加入適量 IFN-γ-PE-CY5、IL-17-PE、IL-22，振蕩1～2 s，避光孵育 20 min，用 PBS 洗滌細胞，離心 5 min，傾去上清液。重懸細胞于鞘液中，利用流式細胞儀檢測。試驗象限確定依據用于試驗的相應熒光對照，資料采用MXP軟件分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以±s表示，偏態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用t檢驗或U檢驗，變量間的相關性采用Pearson直線相關分析。采用MedCal統計軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組間Th22、Th1、Th17水平比較 乙型肝炎組、HBV-SACLF組患者外周血Th22、Th1、Th17水平明顯高于健康對照組，HBV-SACLF組患者外周血Th22、Th1、Th17水平明顯高于乙型肝炎組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組間 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

表2 三組間 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

注：與健康對照組比較，aP＜0.05；與乙型肝炎組比較，bP＜0.05

組別健康對照組乙型肝炎組SACLF組Th1 3.40±1.31 5.51±1.89a 8.92±3.11ab Th17 3.38±1.62 6.67±1.66a 8.92±2.77ab Th22 2.34±1.10 5.22±1.76a 7.85±3.22ab

2.2 HBV-SACLF不同時期Th22、Th1、Th17水平比較HBV-SACLF晚期Th22、Th1、Th17水平明顯高于中期和早期，中期Th22、Th1、Th17水平明顯高于早期，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 HBV-SACLF 不同時期 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

表3 HBV-SACLF 不同時期 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

注：與HBV-SACLF早期組比較，aP＜0.05；與HBV-SACLF中期組比較，bP＜0.05

組別HBV-SACLF早期組HBV-SACLF中期組HBV-SACLF晚期組Th1 6.63±0.61 7.82±0.56a 10.52±2.34ab Th17 6.71±0.99 8.59±0.57a 9.94±1.29ab Th22 5.65±1.28 6.99±0.97a 9.11±1.22ab

2.3 HBV-SACLF患者外周血Th22、Th1、Th17之間的關系 在HBV-SACLF患者外周血中Th1與Th17、Th22呈明顯正相關（r=0.715，P＜0.000 1；r=0.579，P=0.000 7）；Th17與Th22呈明顯正相關（r=0.693，P＜0.0001），見圖1。

圖1 HBV-SACLF患者外周血Th22、Th1、Th17之間的關系

2.4 HBV-SACLF外周血T細胞與相關指標的關系 Th22、Th1、Th17分別與 TBIL、MELD 評分呈正相關（P＜0.05），與 ALB 呈負相關（P＜0.05），與 AST、ALT 及 HBV-DNA無相關性（P＞0.05）。見表4。

表4 HBV-SACLF患者外周血T細胞與相關指標的關系

2.5 Th22、Th1、Th17對SACLF的預測價值 以臨床診斷作為“金標準”繪制ROC曲線，結果顯示，Th1、Th17、Th22檢測對SACLF發生有預測作用，曲線下面積（AUC）分別為 0.817、0.802、0.753。以 Th1、Th17、Th22為自變量，建立Logistic回歸模型，擬合方程Logit（P）=6.404-0.459 8×Th17+0.118 6×Th1-0.377 8×Th22，聯合預測AUC為0.854，聯合檢測ROC曲線AUC與Th1、Th17、Th22單項檢測AUC比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2、表5。

3 討 論

圖 2 Th22、Th1、Th17的 ROC 曲線

表5 Th22、Th1、Th17對SACLF的預測價值

Th17細胞是一種獨特的CD4+效應T細胞，其能分泌 IL-17、IL-22、IL-26 和腫瘤壞死因子 α（TNF-α）等細胞因子，其中，IL-17是Th17最具特征性的細胞因子。研究表明，Th17細胞及其相關細胞因子與慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、缺血/再灌注肝損傷、自身免疫性肝病等肝臟疾病的發生、發展有關[9]。Th22是一種近年來新發現的CD4+T細胞，其能夠特異性分泌IL-22。正常情況下，Th22與Th1、Th2、Th17等其他T細胞亞群互相調控，使機體處于平衡狀態。在炎性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病中，Th22通過分泌IL-22、TNF-α、IL-26等效應因子參與疾病的進程[10]。Th1細胞為傳統的Ⅰ型輔助性T淋巴細胞，其能分泌IFN-γ，促進CD8+T細胞增殖分化為CTL細胞，以清除感染病毒的靶細胞，從而造成組織損傷[11]。研究發現，在HBV感染細胞后，患者外周血中Th1水平明顯增高，且在急性肝衰竭中增高幅度更大，表明Th1在肝臟疾病的發生、發展中發揮了重要作用[12-13]。在本研究中，HBV-SACLF組外周血Th22、Th1、Th17水平明顯高于乙型肝炎組和健康對照組；在 HBV-SACLF早、中、晚期 Th22、Th1、Th17 水平也逐漸升高，且Th22、Th1、Th17分別與TBIL呈正相關，與ALB呈負相關，提示Th22、Th1、Th17參與了肝臟損傷的發展過程，其水平能夠反映疾病的嚴重程度和肝臟的儲備功能。MELD評分是臨床應用最為廣泛的肝病病情評估及預后判斷的評分模型，MELD評分越高，肝病預后越差。本研究結果顯示，外周血Th22、Th17及Th1與MELD評分呈正相關，提示HBV-SACLF患者外周血Th22、Th17及Th1水平與疾病的預后相關。本研究中，作者還對Th22、Th1、Th17之間的關系進行了研究，結果顯示，在HBV-SACLF中，Th22水平與Th1及Th17呈正相關，且Th1水平與Th17也呈正相關，提示在HBV-SACLF發病進程中，Th22、Th1、Th17可能起協同作用。這可能是因為在HBV-SACLF發生、發展中，相關免疫細胞被活化，分泌的細胞因子如IL-6、IL-12、IL-21等能夠促進Th22、Th1、Th17的增殖、分化，這3類細胞能夠分泌多種細胞因子介導肝臟損傷。例如，IFN-γ能增強Tc細胞的增殖，加重肝臟細胞損傷；IL-17，IL-22能誘導炎性細胞因子、趨化因子等導致肝臟的炎性損傷。至于三者間確切的作用機制此后還需進一步研究。

肝衰竭發病機制復雜，病情進展至肝衰竭時，短期病死率極高。因此，需對HBV-SACLF發生風險進行預測，并采取措施對高風險的感染者進行早期干預，從而達到預防肝衰竭發生的目的。相關研究報道，在肝衰竭發生前給予患者短時小劑量激素治療能夠明顯降低肝衰竭的發生率，肝衰竭前期抗病毒治療能明顯改善患者的預后，提高其生存率。本研究通過比較各指標ROC曲線AUC，判斷其對肝衰竭的預測價值。文獻報道，ROC曲線AUC為0.5以下時無診斷價值，AUC為0.5～0.7時有較低的準確性，AUC為大于0.7～0.9時有較高的準確性，AUC為0.9以上時準確性最高[14]。本研究結果顯示，Th22、Th1、Th17 的 AUC 分別為 0.817、0.802、0.753，提示 Th22、Th1、Th17 在 HBV-SACLF 預測方面有一定的價值。聯合檢測的ROC曲線AUC雖然高于任一單項檢測，但與單項檢測的AUC比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），提示聯合檢測的預測價值并不優于單項檢測，不過在研究中作者發現聯合檢測有較高的敏感度。

綜上所述，Th22、Th1、Th17水平在 HBV-SACLF 患者外周血中升高，其水平能夠反映HBV-SACLF的嚴重程度，且在預測HBV-SACLF發生方面有一定的價值。

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