圓鰹暗色肉蛋白酶解物的抗疲勞作用

陳義明,曹文紅,2,3,4,5,章超樺,2,3,4,5,*,盧虹玉,2,3,4,5,曾少葵,2,3,4,5,高加龍,2,3,4,5,鄭慧娜,2,3,4,5

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088;3.廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088;4.國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),廣東湛江 524088;5. 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),廣東湛江 524088)

圓鮀鰹(Auxistapeinosoma)屬硬骨魚亞綱鱸形目鯖亞目金槍魚科,為暖水性中上層魚類[1]。暗色肉是金槍魚加工過程中的副產(chǎn)物,因其顏色深、易氧化、有異味和功能性較差等缺點(diǎn),主要用于生產(chǎn)魚粉和肥料等低值的產(chǎn)品[2]。蘇陽等[3]對(duì)圓鮀鰹的普通肉和暗色肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)圓鮀鰹普通肉和暗色肉粗蛋白(干基)含量分別為87.72%和81.07%,必需氨基酸評(píng)分分別為96和89,DHA+EPA的含量占總脂肪的 17%～28%。此外,兩者均含有豐富的 Ca、Fe、Zn等礦物元素,表明暗色肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。章超樺等[4]初步研究圓鮀鰹肌肉組織酶解物的抗疲勞作用,結(jié)果表明，圓鮀鰹普通肉和暗色肉酶解物均具有抗疲勞作用。前期研究暗色肉粗酶解物(DMH)的抗疲勞作用,但是DMH中的成分非常復(fù)雜,主要成分為多肽和氨基酸為主的粗蛋白,還有少量的糖、粗脂肪和灰分,其中主要的抗疲勞活性物質(zhì)尚不明確。

為了進(jìn)一步探討DMH的抗疲勞作用是否主要與其中所含的蛋白相關(guān),還是蛋白與其他成分的協(xié)同作用,本文采用堿溶酸沉法提取圓鮀鰹暗色肉蛋白質(zhì)(dark muscle protein,DMP),使用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解DMP,研究暗色肉蛋白酶解物(dark muscle protein hydrolysate,DMPH)的基本成分、氨基酸組成和抗疲勞作用,并與DMH進(jìn)行比較,初步推測(cè)DMH中主要的抗疲勞活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圓鮀鰹 由雷州市運(yùn)源水產(chǎn)有限公司提供,去除頭、骨、皮,取肌肉組織中的暗色肉,絞肉機(jī)攪碎分裝于聚乙烯袋中,-40 ℃保存直到使用;中性蛋白酶(20萬U/g)、木瓜蛋白酶(20萬U/g) 廣西龐博生物工程有限公司;乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肝糖原試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測(cè)試盒、過氧化氫酶測(cè)試盒和超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程有限公司;西洋參含片 佛山市順德康富來保健品有限公司;雄性昆明小鼠 120只(SPF級(jí)),體重18～22 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證編號(hào):SCXK(粵)2016-0041。

T25分散均質(zhì)機(jī) 艾卡(中國(guó))儀器設(shè)備有限公司;RW20攪拌器 艾卡(中國(guó))儀器設(shè)備有限公司;Thermo Lynx6000高速落地離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;R-1005旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;FDU-1100真空冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社;Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 圓鮀鰹 DMP制備 參照鄭惠娜等[5]方法,稍做修改,稱取1000 g暗色肉,按1∶3比例加入蒸餾水,高速分散機(jī)10000 r/min勻漿后,采用 0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為12,然后4 ℃冰浴中用攪拌器攪拌3 h后,以9000 r/min,4 ℃離心15 min取上清液,用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH為5.1,以9000 r/min,4 ℃離心15 min取沉淀,即得到圓鮀鰹DMP備用。

1.2.2 DMH和DMPH制備 參照蘇陽等[6]的方法,分別取暗色肉和制備的DMP進(jìn)行酶解,按料水比1∶3加入蒸餾水,pH6.8,原料中木瓜蛋白酶1100 IU/g,中性蛋白酶1400 IU/g,50 ℃條件下酶解2.5 h,酶解產(chǎn)物于100 ℃滅酶10 min后,以5000 r/min離心10 min取上清液,上清液于50 ℃真空條件下濃縮至體積為200 mL左右,真空度50 Pa,溫度-35 ℃ 條件下冷凍干燥得DMH和DMPH,放入超低溫冰箱備用。

1.2.3 DMH和DMPH基本成分測(cè)定 粗蛋白的測(cè)定:自動(dòng)凱氏定氮儀法(GB 5009.5-2016)[7];灰分的測(cè)定:高溫灼燒法(GB 5009.4-2016)[8];粗脂肪的測(cè)定:索氏提取法(GB 5009.6-2016)[9];總糖含量測(cè)定:苯酚硫酸法(GB/T 9695.31-2008)[10]。

1.2.4 氨基酸組成測(cè)定 DMH和DMPH中氨基酸測(cè)定參照Cao等[11]方法,樣品經(jīng)6 mol/L HCl于(110±1) ℃水解22 h后,用高速氨基酸分析儀進(jìn)行17種組成蛋白質(zhì)氨基酸含量的分析。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 分籠飼養(yǎng),每5只一籠,室溫(22±2) ℃,相對(duì)濕度50%±10%,噪音小于60 dB,日光燈的明暗間隔為12 h,自由飲食和飲水。經(jīng)過1周的適應(yīng)期后,120只小鼠隨機(jī)平均分成6個(gè)組。按人體(以60 kg體重計(jì))推薦量每日3.75 g的10倍,設(shè)置西洋參灌胃劑量為0.6 g/(kg·d)作為陽性組,低劑量組灌胃劑量為0.6 mg/g·d蛋白,高劑量組灌胃劑量為3.6 mg/g·d蛋白。西洋參含片粉末、DMH和DMPH在灌胃前配制成水溶液,每天上午9點(diǎn)進(jìn)行灌胃,連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及灌胃情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及灌胃劑量

1.2.6 圓鮀鰹DMH和DMPH的體內(nèi)抗疲勞活性

1.2.6.1 小鼠力竭游泳測(cè)試 每組隨機(jī)取10只小鼠進(jìn)行力竭游泳測(cè)試,最后一次灌胃后,小鼠允許休息30 min。在小鼠鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛墜后,將其置于水深約30 cm,水溫(25±1) ℃的游泳箱中游泳。在實(shí)驗(yàn)過程中需使小鼠的四肢保持運(yùn)動(dòng),若小鼠漂浮不動(dòng),可在其附近攪動(dòng)水流迫使其運(yùn)動(dòng)。用秒表記錄小鼠從游泳開始至頭部完全沉入水中7 s不露出水面的時(shí)間為小鼠力竭游泳時(shí)間[12]。

1.2.6.2 疲勞相關(guān)的生化參數(shù)測(cè)定 最后一次灌胃后,小鼠允許休息30 min。將小鼠置于水深約30 cm,溫度(25±1) ℃的游泳箱中游泳。游泳90 min后取出小鼠,眼球取血,血用于測(cè)定乳酸、尿素氮的含量與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力。小鼠當(dāng)即處死取肝臟,經(jīng)生理鹽水洗凈血水后用濾紙吸干放入密封袋中-40 ℃保存,肝臟用于測(cè)定肝糖原含量。乳酸、尿素氮和肝糖原含量以及SOD、CAT和GSH-Px活力測(cè)定均使用試劑盒,所有生化參數(shù)的檢測(cè)均使用酶標(biāo)儀。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DMH和DMPH的基本成分

DMH和DMPH的基本成分測(cè)定結(jié)果如表2所示,DMP酶解后DMPH的粗蛋白含量顯著高于DMH(p<0.05),DMPH的總糖、灰分和粗脂肪的含量顯著低于DMH(p<0.05),說明堿溶酸沉法可以脫除暗色肉中部分多糖和粗脂肪,DMP酶解后DMPH中的粗蛋白含量升高。

表2 DMH和DMPH基本成分(%,干基)

2.2 DMH和DMPH的氨基酸組成

DMH和DMPH的氨基酸組成測(cè)定結(jié)果如表3所示,DMDP中氨基酸總濃度高于DMH，分別為69.80、78.05 g氨基酸殘基/100 g暗色肉酶解粉，DMH和DMPH中分別含有17.91%和17.82%的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸,支鏈氨基酸可以提高運(yùn)動(dòng)能力和顯著延緩運(yùn)動(dòng)過程中肌肉中蛋白質(zhì)的分解代謝[13]。DMH中支鏈氨基酸含量與DMPH相近,表明DMH和DMPH均能提高運(yùn)動(dòng)能力。此外,支鏈氨基酸還能減少運(yùn)動(dòng)過程中血液乳酸的積累,減輕血液乳酸導(dǎo)致的疲勞[10]。

表3 DMH和DMPH氨基酸組成

2.3 DMH和DMPH對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

小鼠力竭游泳測(cè)試結(jié)果如圖1所示,與空白組相比,DMH和DMPH不同劑量組均能顯著地延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間(p<0.05)。DMH-H組和DMPH-H組小鼠力竭游泳時(shí)間顯著高于陽性組(p<0.05)。DMH -H組小鼠力竭游泳時(shí)間顯著高于DMH-L組(p<0.05),DMPH-L組和DMPH-H組無顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果表明，DMH和DMPH均具有抗疲勞作用,但是兩者無顯著性差異(p>0.05)。增加運(yùn)動(dòng)耐受性是直接測(cè)量抗疲勞作用的方法。負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)模型用來評(píng)價(jià)抗疲勞作用,可以增加小鼠的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度從而縮短研究時(shí)間,力竭游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以表示疲勞的程度。

圖1 DMH和DMPH對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

2.4 DMH和DMPH對(duì)小鼠乳酸、尿素氮、肝糖原含量的影響

小鼠血漿乳酸測(cè)定結(jié)果如表4所示,DMH和DMPH不同劑量組小鼠游泳90 min后,血液中乳酸含量顯著低于空白組(p<0.05),DMH-L和DMH -H分別降低29.2%和32.5%,DMPH-L和DMPH-H組分別降低37.6%和42.0%。DMH和DMPH不同劑量組小鼠乳酸含量顯著低于陽性組(p<0.05)。DMH-L和DMH -H組間無顯著性差異(p>0.05),DMH-L組和DMPH-H組間無顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果表明,DMH和DMPH能幫助清除或者延緩小鼠體內(nèi)乳酸的積累,從而起到抗疲勞的作用。糖酵解是短時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)的主要能量來源[14]，乳酸是無氧條件下碳水化合物糖酵解的產(chǎn)物,因此,血液乳酸是判斷疲勞程度的重要指標(biāo)之一。然而,研究發(fā)現(xiàn)，乳酸本身不是疲勞發(fā)展的直接原因,從乳酸上解離的H+能改變體內(nèi)的pH,損傷某些器官和產(chǎn)生疲勞[15]。

表4 小鼠乳酸、尿素氮和肝糖原含量

小鼠血漿尿素氮測(cè)定結(jié)果如表4所示,DMH和DMPH不同劑量組小鼠尿素氮含量顯著低于空白組(p<0.05),DMH-L和DMH -H分別降低29.3%和33.2%,DMPH-L和DMPH-H組分別降低17.6%和29.2%。DMH不同劑量組和DMPH-H組小鼠尿素氮含量顯著低于陽性組(p<0.05)。DMH-L組和DMH -H組間無顯著性差異(p>0.05),DMPH-H組尿素氮含量顯著低于DMPH-L組(p<0.05)。DMH-L組尿素氮含量顯著低于DMPH-L組(p<0.05),DMH-H組與DMPH-H組間無顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果表明,DMH和DMPH均能為小鼠機(jī)體提供能量,減緩蛋白質(zhì)代謝水平,提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐受力,有一定抗疲勞功效。當(dāng)身體不能由糖和脂肪的分解代謝獲得足夠的能量時(shí),蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加強(qiáng),尿素氮是蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的產(chǎn)物,長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行分解代謝后,體內(nèi)尿素氮顯著增加。所以,血液中的尿素氮含量的高低是衡量機(jī)體否疲勞一個(gè)重要指標(biāo)。體內(nèi)尿素氮的含量與運(yùn)動(dòng)耐受性呈正相關(guān),身體的運(yùn)動(dòng)耐受性越差,尿素氮含量增加的越多[16]。

小鼠肝糖原測(cè)定結(jié)果如表4所示,DMH和DMPH劑量組小鼠肝糖原含量顯著高于空白組(p<0.05),DMH-L和DMH -H分別為空白組的1.61和1.79倍,DMPH-L和DMPH-H組分別為空白組的1.62和1.65倍。DMH-L組和DMH-H組間無顯著性差異(p>0.05),DMPH-L組和DMPH-H組間無顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果表明,DMH和DMPH能改善小鼠的能量代謝體系,從而提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的耐受能力,具有一定的抗疲勞功效。糖原是運(yùn)動(dòng)期間重要的能量來源,糖原的作用是補(bǔ)充血糖的消耗和維持血糖在正常的生理范圍。當(dāng)糖原被大量消耗時(shí),疲勞便會(huì)發(fā)生。因此,肝糖原含量是測(cè)定疲勞是否發(fā)生的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

2.5 DMH和DMPH對(duì)小鼠抗氧化酶的影響

2.5.1 DMH和DMPH對(duì)小鼠SOD活力的影響 小鼠血漿SOD測(cè)定結(jié)果如圖2(a)所示,DMPH組小鼠SOD活力顯著高于空白組(p<0.05),DMH 組小鼠SOD活力與空白組無顯著性差異(p>0.05),陽性組小鼠SOD活力顯著高于空白組(p<0.05),DMH和DMPH組小鼠SOD活力與空白組無顯著性差異(p>0.05)。DMH-L組和DMH -H組間無顯著性差異(p>0.05),DMPH-L組和DMPH-H組間無顯著性差異(p>0.05)。

2.5.2 DMH和DMPH對(duì)小鼠CAT活力的影響 小鼠血漿CAT測(cè)定結(jié)果如圖2(b)所示,DMH組和DMPH組小鼠CAT活力顯著高于空白組(p<0.05),DMH組和DMPH組小鼠CAT活力顯著高于陽性組(p<0.05)。DMH組和DMPH組間無顯著性差異(p>0.05)。

2.5.3 DMH和DMPH對(duì)小鼠GSH-Px活力的影響 小鼠血漿GSH-Px測(cè)定結(jié)果如圖2(c)所示,DMH組和DMPH組小鼠GSH-Px活力顯著高于空白組(p<0.05),DMH組小鼠GSH-Px活力顯著高于陽性組(p<0.05),DMPH組小鼠GSH-Px活力與陽性組無顯著性差異(p>0.05)。DMH-L組和DMH -H組間無顯著性差異(p>0.05),DMPH-L組和DMPH-H組間無顯著性差異(p>0.05)。越來越多的研究表明,活性氧是蛋白質(zhì)氧化的原因,而且強(qiáng)烈導(dǎo)致肌肉疲勞[14]。

圖2 DMH和DMPH對(duì)小鼠抗氧化酶活力的影響

抗氧化酶系統(tǒng)(包括SOD、GSH-Px和CAT等)在清除自由基和其代謝產(chǎn)物方面是重要的,而且還能維持正常的細(xì)胞生理學(xué),促進(jìn)免疫功能和預(yù)防各種疾病[18]。結(jié)果表明,DMH和DMPH具有抗氧化活性，能提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)過程中自由基的清除。在生物系統(tǒng)中,自由基以活性氧的形式產(chǎn)生,如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、氧化氮和過氧亞硝酸鹽。過量產(chǎn)生的自由基將導(dǎo)致氧化應(yīng)激,能導(dǎo)致組織損傷和疲勞[19]。具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物能預(yù)防自由基攻擊,許多蛋白質(zhì)酶解物及其分離的多肽已經(jīng)顯示出抗氧化活性與抗疲勞作用,包括草魚[20]、鮐魚[21]和泥鰍[22]。

3 結(jié)論

DMPH的粗蛋白含量顯著高于DMH(p<0.05),DMPH的總糖、灰分和粗脂肪的含量顯著低于DMH(p<0.05)。DMH和DMPH中氨基酸組成全面,DMPH的氨基酸總濃度高于DMH。DMH中支鏈氨基酸含量與DMPH相近。DMH和DMPH能延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間,減少肝糖原的消耗,通過降低乳酸和尿素氮含量幫助消除代謝產(chǎn)物的累積,而且還可提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力,DMH和DMPH均具有抗疲勞作用,但是無顯著性差異。

與DMH相比,DMPH中粗蛋白和氨基酸含量更高,可以推測(cè)暗色肉中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的多肽和氨基酸是DMH中主要的抗疲勞活性物質(zhì)。本研究結(jié)果可以為抗疲勞功能產(chǎn)品的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。然而,對(duì)其抗氧化活性及抗疲勞作用機(jī)制還需深入研究。

[1]李鈺金,隋娟娟,李銀塔,等. 金槍魚魚松的工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā),2012(3):67-70.

[2]Nalinanon S,Benjakul S,Kishimura H,et al. Functionalities and antioxidant properties of protein hydrolysates from the muscle of ornate threadfin bream treated with pepsin from skipjack tuna[J]. Food Chemistry,2011,124(4):1354-1362.

[3]章超樺,蘇陽,曹文紅,等. 南海圓鮀鰹肌肉組織酶解產(chǎn)物抗疲勞活性的初步研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2017,20(3):43-49.

[4]蘇陽,章超樺,曹文紅,等. 南海產(chǎn)3種金槍魚普通肉、暗色肉營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(3):87-93.

[5]鄭惠娜,張晶晶,周春霞,等. pH調(diào)節(jié)法提取牡蠣蛋白及氨基酸、蛋白組成分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2014(7):230-235.

[6]蘇陽. 南海產(chǎn)3種金槍魚營(yíng)養(yǎng)成分分析及肌肉蛋白酶解物抗疲勞活性的研究[D]. 湛江:廣東海洋大學(xué),2015.

[7]全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB 5009.5-2016，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，食品蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[8]全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB 5009-4-2016，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，食品中灰分的測(cè)定[S].

[9]全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB 5009.6-2016,食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，食品中脂肪的測(cè)定[S].

[10]全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB/T 9695.31-2008，肉制品總糖含量測(cè)定[S].

[11]Cao W,Zhang C,Hong P,et al. Autolysis of shrimp head by gradual temperature and nutritional quality of the resulting hydrolysate[J]. LWT-Food Science and Technology,2009,42(1):244-249.

[12]Jung K-A,Han D,Kwon E-K,et al. Antifatigue effect of rubus coreanus miquel extract in mice[J]. Journal of Medicinal Food,2007,10(4):689-693.

[13]Blomstrand E,Newsholme EA. Effect of branched-chain amino acid supplementation on the exercise-induced change in aromatic amino acid concentration in human muscle[J]. Acta Physiolscand,1992,146(3):293-298.

[14]Negro M,Giardina S,Marzani B,et al. Branched-chain amino acid supplementation does not enhance athletic performance but affects muscle recovery and the immune system[J]. Journal of Sports Medicine and Physical Fitness,2008,48(3):347-351.

[15]Wang JJ,Shieh MJ,Kuo S-L,et al. Effect of red mold rice on antifatigue and exercise-related changes in lipid peroxidation in endurance exercise[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,70(2):247-53.

[16]Wang L,Zhang HL,Lu R,et al. The decapeptide CMS001 enhances swimming endurance in mice[J]. Peptides,2008,29(7):1176-1182.

[17]Zhang Y,Yao X,Bao B,et al. Anti-fatigue activity of a triterpenoid-rich extract from Chinese bamboo shavings(Caulis bamfusae in taeniam)[J]. Phytotherapy Research,2006,20(10):872-876.

[18]Powers SK,DeRuisseau KC,Quindry J,et al. Dietary antioxidants and exercise[J]. Journal of sports sciences,2004,22(1):81-94.

[19]S?zmen EY,S?zmen B,Girgin FK,et al. Antioxidant enzymes and paraoxonase show a co-activity in preserving low-density lipoprotein from oxidation[J]. Clinical and experimental medicine,2001,1(4):195-199.

[20]任嬌艷. 草魚蛋白源抗疲勞生物活性肽的制備分離及鑒定技術(shù)研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2008.

[21]Wang XQ,Xing RE,Chen ZY,et al. Effect and mechanism of mackerel(Pneumatophorus japonicus)peptides for anti-fatigue[J]. Food & Function,2014,5(9):2113-2119.

[22]You L,Zhao M,Regenstein JM,et al.Invitroantioxidant activity andinvivoanti-fatigue effect of loach(Misgurnusanguillicaudatus)peptides prepared by papain digestion[J]. Food Chemistry,2011,124(1):188-194.