兒童呼吸道標本肺炎鏈球菌的耐藥性監測

楊曉華， 陳燕輝， 石冬梅， 譚 南， 王桂蘭， 林愛心， 袁春雷， 彭建明， 蔡鳳娟

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起兒童上呼吸道感染和全身侵襲性感染的常見病原菌，全球每年有300萬兒童死于由肺炎鏈球菌感染引起的肺炎、菌血癥或腦膜炎，是導致發展中國家5歲以下兒童死亡的主要原因[1]。長期以來，肺炎鏈球菌對青霉素高度敏感，該藥遂成為治療其感染的首選藥物，隨著臨床上抗生素的大量使用，肺炎鏈球菌出現了對青霉素和大環內酯類抗生素耐藥，而且出現了對其他抗生素的多重耐藥。多重耐藥的肺炎鏈球菌已逐漸成為全球性問題，不同地區的肺炎鏈球菌對各類抗菌藥物的耐藥譜變化具有不同的特點。為了解中山市博愛醫院兒童呼吸道感染肺炎鏈球菌的耐藥情況，對我院兒科2013－2017年從呼吸道分離的肺炎鏈球菌流行狀況及其對抗菌藥物的耐藥性進行分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2013年5月－2017年8月在我院兒科診斷為下呼吸道感染并進行痰細菌培養的門診及住院患兒。下呼吸道感染診斷標準參照《諸福棠實用兒科學》[2]。臨床以患者出現咳嗽、痰黏稠、肺部出現濕啰音，并有下列情況之一的即可診斷為下呼吸道感染：①發熱；②白細胞總數和中性粒細胞比例增高；③胸部X線顯示肺部有炎性浸潤性病變。在此期間共收治肺炎患兒28 006例，年齡1 d～14歲。

1.1.2 培養基 哥倫比亞瓊脂、MH瓊脂為英國OXOID公司產品，自制5%綿羊血血瓊脂平皿和MHA平皿。去氧膽酸鈉，購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 藥敏紙片 Optochin紙片及各抗生素紙片均購自英國OXOID公司。青霉素、頭孢曲松的E試驗紙條，為瑞士AB Bio-Disk公司產品。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC 49619。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采用氣管插管結合負壓吸引方法采集痰液標本，根據痰液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）直接涂片革蘭染色鏡檢結果，符合以下標準者[3]列為研究對象：①WBC＞25/LP，上皮細胞≤10/LP；②WBC≥25/LP，上皮細胞10～25/LP；③WBC≥25/LP，上皮細胞＞10/LP且兩者比例＞2.5∶1。不合格的痰液標本退回重新取樣。剔除同一患兒同一時期重復送檢的標本。

1.2.2 菌株分離和鑒定 合格痰液標本接種于血平皿、巧克力平皿、麥康凱平皿，置35 ℃含6%CO2孵箱培養18～24 h后，對肺炎鏈球菌的可疑菌落，進行Optochin紙片檢測，膽汁溶菌試驗和菊糖發酵。生化不典型的菌落用VITEK 2-Compact GP卡上機鑒定。菌株的分離與鑒定參照《全國臨床檢驗操作規程》[4]進行。

1.2.3 藥敏測定 參照2017年CLSI M100- S27[5]有關抗生素敏感性試驗法規進行試驗。用紙片擴散法測定細菌對紅霉素、克林霉素、四環素、氯霉素、氧氟沙星、萬古霉素、利奈唑胺和甲氧芐啶-磺胺甲 唑的敏感性；采用E試驗法測定青霉素和頭孢曲松對細菌的MIC。

1.2.4 結果判斷 按照CLSI M100- S27[5]對非腦膜炎株肺炎鏈球菌青霉素的敏感性判斷折點：青霉素MIC≤2 mg/L為青霉素敏感肺炎鏈球菌（PSSP），MIC 4 mg/L為青霉素中介肺炎鏈球菌（PISP），MIC≥8 mg/L為青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP）。頭孢曲松對肺炎鏈球菌的MIC≤1 mg/ L為敏感，MIC 2 mg/L為中介，MIC≥4 mg/L為耐藥。

1.2.5 統計學方法 采用WHONET 6.0軟件進行數據處理和統計分析。用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺炎鏈球菌的總體檢出情況

2013年5月－2017年8月，28 006例患者痰標本中共鑒定出2 963株肺炎鏈球菌，總檢出率為10.6%。28 006例患兒中男17 453例，女10 553例。肺炎鏈球菌檢出率男患兒1 842/17 456，10.6%；女患兒為1 121/10 553，10.6%，兩者檢出率差異無統計學意義（P=1.0）。

從各月份的檢出率中，肺炎鏈球菌檢出以每年的冬春季為高。各月份的檢出率見圖1。

圖1 2013－2017年兒童肺炎鏈球菌月檢出率Figure 1 The prevalence of Streptococcus pneumoniae in sputum samples from respiratory tract of children from 2013 through 2017

2.2 不同年齡肺炎患兒肺炎鏈球菌的分布情況

各年齡段肺炎鏈球菌分離菌株數見表1。經χ2檢驗，各年齡段肺炎鏈球菌檢出率差異總體上有統計學意義，χ2=199.561，P＜0.001。其中各年齡段兩兩比較，除＞1～3歲和＞3～6歲組，χ2=0.013，P=0.911，P＞0.05，差異無統計學意義外，其他各組之間差異均有統計學意義。此結果表明：＞1～3歲和＞3～6歲組肺炎鏈球菌檢出率明顯高于其他各組。

表1 不同年齡段肺炎鏈球菌分離菌株數Table 1 Number of Streptococcus pneumoniae isolates in terms of patient age

2.3 肺炎鏈球菌不同年份的檢出率

2013－2017年肺炎鏈球菌的年檢出率分別為7.5%、9.3%、10.9%、12.1%、13.2%，經χ2檢驗，χ2=90.849，P＜0.001，差異有統計學意義。可見每年的檢出率呈逐年上升的趨勢。

2.4 肺炎鏈球菌對抗菌藥物的敏感性

PISP和PRSP對各種抗菌藥物的耐藥率高于PSSP組。PISP對頭孢曲松和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率，明顯高于PSSP，χ2值分別為27.107和360.91，P值均＜0.001，差異有統計學意義；對其他抗菌藥物的耐藥率差異均無統計學意義。見表2。

2.5 肺炎鏈球菌合并其他菌株的多重感染狀況

在檢出的2 963株肺炎鏈球菌的感染病例中，單一感染肺炎鏈球菌的患兒1 689例，占57.0%；混合其他細菌感染的有1 274例，占43.0%。混合1株菌感染的有1 114例，占混合感染的87.4%（1 114/1 274）。其中混合感染菌比例由高到低依次為卡他莫拉菌41.8%（533/1 274），流感嗜血桿菌32.0%（408/1 274），副流感嗜血桿菌5.2%（66/1 274），金黃色葡萄球菌5.0%（64/1 274），大腸埃希菌2.0%（25/1 274）。混合2株菌感染的有160例，占12.6%（160/1 274），其中最常見的為卡他莫拉菌和流感嗜血桿菌有90例，占56.2%（90/160），其次為卡他莫拉菌和金黃色葡萄球菌26例，占16.2%（26/160），流感嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌21例，占13.1%（21/160）。

3 討論

大約1/4健康兒童的鼻咽部攜帶肺炎鏈球菌，該菌是引起兒童細菌性肺炎和腦膜炎的最常見病原菌，其導致的兒童重癥肺炎約占所有病原菌的50%，在兒童肺炎致死病例中也可達到50%[6]。本組資料顯示，2013－2017年，下呼吸道感染患兒肺炎鏈球菌檢出率從2013年7.5%到2017年的13.2%，與2008年的檢出率5.5%[7]比較，呈逐年遞增趨勢。

肺炎鏈球菌的檢出有明顯的季節性。以每年的冬春季為高，尤以11月和2月為最高，此時正值秋冬和冬春交替的時節，受溫差變化的影響，易發生呼吸系統疾病。這與大部分的研究結果相符[8]。從28 006份標本中共檢出2 963株肺炎鏈球菌，檢出率為10.6%。有97.0%（2 874/2 963）的分離株分布在29 d～6歲的年齡段，說明高發年齡為29 d～6歲兒童，其中＞1～3歲和＞3～6歲組肺炎鏈球菌的檢出率為最高；此年齡段的兒童免疫功能低，易致病。嬰幼兒呼吸系統生理解剖上的特點為沒有鼻毛，鼻黏膜柔弱且富于血管易受感染，氣管、支氣管管腔狹窄，黏液分泌少，纖毛運動差，肺彈力組織發育差等，導致病原菌難以被排出而易于擴散，加之免疫系統發育未健全[2]，是肺炎鏈球菌感染率高的原因。新生兒的檢出率只有1.4%，是所有年齡段中最低的。肺炎鏈球菌是條件致病菌，而新生兒在母體攜帶的免疫抗體還在發揮作用。致病力較弱的肺炎鏈球菌較少引起新生兒肺炎，而多為致病力強的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等引起[2]。在＞6～14歲的年齡段肺炎鏈球菌的檢出率為5.3%，明顯低于其他年齡段。＞6歲的兒童，其自身的免疫功能已發育完善，抵抗力有所增強，肺炎鏈球菌引起的感染隨著年齡的增長其感染率逐漸減少，提示肺炎鏈球菌感染與年齡及免疫功能發育不完全有關。因此在肺炎鏈球菌感染高發季節，我們應對易于感染的嬰幼兒提早做好預防措施，加強和提高嬰幼兒的免疫能力，接種肺炎鏈球菌多價疫苗進行干預，可以降低發病率。

表2 肺炎鏈球菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 2 Susceptibility of Streptococcus pneumoniae strains to antimicrobial agents in terms of their susceptibility to penicillin（%）

本組資料顯示，肺炎鏈球菌的單一感染和混合其他細菌感染的比例大概為1∶1。多種細菌的重疊感染比例如此之高，可見感染的的嚴重性和診治的迫切性。混合1株菌的占混合感染株的87.4%，2株菌的混合感染占12.6%，肺炎鏈球菌混合其他細菌的多重感染情況較為常見。其中最為常見的，也是混合感染比例最高的是與卡他莫拉菌和/或流感嗜血桿菌的多重感染；其次為金黃色葡萄球菌。此3種菌大部分都是產β內酰胺酶菌株，且致病性較強。有研究顯示卡他莫拉菌產酶株與其他致病菌感染共存時，不僅可保護自身不被殺滅， 其產生的β內酰胺酶還可保護其他對藥物敏感的細菌得以生存， 進而間接發揮致病作用[9]。另外當一種細菌或病毒感染機體后，使得機體免疫力下降從而引發多重混合感染。臨床醫師在抗感染治療時應考慮多種細菌或病毒的混合感染情況，并適當增強患兒機體免疫力以預防混合感染的情況。

長期以來，青霉素作為治療肺炎鏈球菌的首選抗生素，一直占據著主導地位。自1967年首次在澳大利亞發現PRSP起，世界各地都先后廣泛報道了肺炎鏈球菌對β內酰胺類、大環內脂類、四環素等抗生素的耐藥，且對青霉素的耐藥率與地域分布有關[10]。近20多年， PRSP菌株的檢出不斷增加，中度耐藥株已在全世界發現，而高度耐藥株也在許多國家出現[2]。本組資料顯示我院青霉素不敏感肺炎鏈球菌為6.0%，還是處于較低水平，低于2014、2015年CHINET的監測數據[11-12]和2012年上海兒童醫院的數據[13]。在2 963株肺炎鏈球菌中PSSP為94.0%，PISP為5.8%，PRSP為0.2%。

青霉素不敏感肺炎鏈球菌除了對青霉素耐藥外，還對紅霉素、四環素、克林霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑等其他非β內酰胺類抗生素產生耐藥性。本組資料顯示，我院兒童中檢出的肺炎鏈球對紅霉素、克林霉素、四環素和甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率分別為98.4%、95.6%、94.3%和82.0%，與其他的監測數據[11-13]大致相仿。

綜上所述，我院兒童感染肺炎鏈球菌的耐藥狀況已很嚴峻。肺炎鏈球菌耐藥幾乎使治療此菌引起的呼吸道和中樞神經系統感染的第一線藥物療效盡失。為了減少耐藥菌株的產生，必須加強本地區肺炎鏈球菌耐藥性和抗生素使用情況的監測，及時調整經驗用藥方案和預防感染策略，大力推廣和接種肺炎鏈球菌的多價疫苗。

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