DNA為模板的納米銀簇探針檢測腫瘤細胞高表達microRNA-21

侯肖肖，孫麗范，樊明玥，孫艷華

（天津醫科大學1.藥學院；2.公共衛生學院，天津300070）

腫瘤發生早期的標志物檢測技術是目前臨床工作者渴望的診斷技術之一。micro RNA(miRNA)是近年來發現的長度約22 nt的內源性短鏈RNA，在腫瘤發生、發展等病理過程中起重要調控作用[1]。miRNA-21在結腸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤中均表現為上調[2-4]，因此成為早期檢測癌癥的潛在靶標。目前，特征miRNA的體外定量檢測手段主要包括反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、微陣列、電化學和熒光法等。但是它們在靈敏度、抗干擾性、生物相容性、操作流程復雜性等方面有待改進。所以，針對腫瘤細胞特異性表達的miRNA開發新型檢測探針成為研究熱點。納米銀簇由于具有較強的熒光發光性、容易制備以及好的生物相容性等優點，成為檢測核酸、蛋白、細胞以及金屬離子等多種目標物的理想傳感材料。納米銀簇由幾個到幾十個銀原子組成[5]，它們的量子效應使其具有類似分子的光學性質[6]。DNA可以作為模板引導調控納米銀簇的形成[7]。同時，檢測目標miRNA時，DNA與miRNA堿基互補配對的高度專一性，導致受DNA調控的納米銀簇內部發生能量轉移，表現在熒光光譜上的改變，成為miRNA的檢測信號。本文使用DNA單鏈引導合成納米銀簇，成功制備了檢測miRNA-21的熒光探針，同時優化了檢測時溶液的pH值和金屬鎂離子的影響條件，為將這一技術實際應用于血清、組織以及細胞中靶標miRNA的檢測提供了依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 硼氫化鈉（NaBH4）、硝酸銀（AgNO3）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、硝酸鎂[Mg（NO3）2]均購買于天津市江天化工技術有限公司，為分析純；DNA序列和miRNA序列均訂購于大連寶生物有限公司，為HPLC純化。miRNA-21 序列：5′-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUGA-3′，模板 DNA 序列：5′-GGG TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT ACC CCC CCCC-3′。胎牛血清購買于AusGeneX公司；實驗用水為超純水（電阻率18.25 MΩ）。RF-5301pe熒光分光光度計（島津），U-3310紫TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT ACC CCC CCCC-3′。胎牛血清購買于AusGeneX公司；實驗用水為超純水（電阻率18.25 MΩ）。RF-5301pe熒光分光光度計（島津），U-3310紫外-可見分光光度計 (日立)，Tecnai G2 F20高分辨透射電鏡（荷蘭FEI），Jasco-810 圓二色譜儀（日本 Jasco），K-30 干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA引導納米銀簇的合成 90 μL的DNA溶液（100 μmol/L）加入到 494.5 μL 的磷酸緩沖溶液（4 mmol/L，pH7.4）中，加入 4 μL 的 Mg（NO3）2溶液(900 mmol/L)，配制成 600 μL 溶液，干式恒溫器中退火處理，95℃，3 min，緩慢降至室溫。取出加入7.5 μL的 AgNO3溶液（7.25 mmol/L），震蕩 2 min，室溫下避光放置 1 h，加入 4 μL新鮮制備的NaBH4（13.5 mmol/L）溶液，立即震蕩3 min，4℃過夜儲存，備用。

1.2.2 miRNA-21的檢測 把合成的DNA/AgNCs探針溶液（15 μmol/L）稀釋10倍，分別加入濃度0、0.01、0.05、0.10、0.30、0.50、0.65、0.75、1.00 和1.20 μmol/L的miRNA-21，室溫下避光放置1 h，進行熒光檢測。

1.2.3 miRNA-21回收率實驗 將胎牛血清于4℃下離心10 min（8 000 r/min）。取上清液，用4 mmol/L的磷酸緩沖溶液（pH7.4）稀釋100倍備用。采取標準加樣法進行miRNA-21回收實驗。

1.2.4 溶液環境優化 pH值優化：配制pH值為3.0、5.0、7.4、9.0 和 11.0 的磷酸緩沖溶液作為反應體系進行DNA/AgNCs的合成，合成步驟同1.2.1。鎂離子濃度優化：配制成鎂離子濃度為 0、2、4、6、8、10和12 mmol/L的反應體系，進行DNA/AgNCs的合成，合成步驟同1.2.1。

2 結果

2.1 熒光探針DNA/AgNCs的性質及對miRNA-21的定性檢測 熒光探針是基于材料的熒光變化進行檢測的，因此納米銀簇的成功合成是后續檢測的關鍵。圖1A是高倍電子顯微鏡下的銀簇形貌，可以看到納米銀簇粒徑均一，平均粒徑為（3±0.8）nm左右，說明已經形成了形態良好的納米銀簇。圖1B（a）表明DNA/AgNCs在430 nm和600 nm處有吸收峰，430 nm代表大的銀顆粒吸收峰，600 nm代表銀簇的最大吸收峰位，1C（a）表明其對應的最大熒光發射峰位于650 nm處。當加入miRNA-21后，發現DNA/AgNCs的最大吸收峰位藍移至550 nm[1B（b）]，相應地，其最大發射峰位也藍移至600 nm[1C（b）]。也就是加入 miRNA-21 后，探針 DNA/AgNCs在650 nm（Ex=600 nm）處的熒光強度降低，而其在600 nm（Ex=550 nm）處的熒光強度顯著上升。圓二色譜結果顯示，加入 miRNA-21 之前[1D（a）]，探針DNA/AgNCs在245nm處有一負的吸收峰，在275nm處有一正的吸收峰；當加入目標miRNA-21后，其負峰位移至240 nm處，正峰移至265nm處[1D（b）]。

2.2 miRNA的定量檢測 如圖2A所示，隨著miRNA-21的濃度逐漸增加，DNA/AgNCs在600 nm處的熒光強度逐漸增加。圖2A中的插圖是DNA/AgNCs的熒光強度與miRNA-21濃度在0～1 000 nmol/L的濃度范圍的線性關系圖，其擬合方程為 y=0.23x+158.0（R2=0.992 8），其最低檢測限19.30 nmol/L(3σ/S,σ是10次空白溶液的標準差，S是標準曲線的斜率)。如圖2B所示，對目標miRNA-21特異性檢測實驗證明，DNA/AgNCs探針除了對miRNA-182有一定程度的非特異性應答外，miRNA-195，miRNA-155，miRNA-31 對 DNA/AgNCs檢測miRNA-21幾乎不產生影響。

2.3 血清回收實驗 采取標準加入法進行miRNA-21的血清檢測回收率計算。向不含有miRNA-21胎牛血清中加入不同濃度的miRNA-21配成標準溶液，其加標回收結果見表1，miRNA-21在胎牛血清中的平均回收率在93.0%～110.0%范圍內。

2.4 檢測miRNA-21目標時的環境優化 為了滿足實際生化檢測的靈敏度要求，我們探索了檢測環境pH值和對核酸結構有敏感調控的Mg2+對目標檢測效果的影響。

圖1 DNA/AgNCs的合成以及可行性驗證Fig 1 DNA/AgNCs synthesis and feasibility verification

圖2 不同濃度miRNA-21的DNA/AgNCs熒光圖譜和miRNA-21的特異性檢測Fig 2 Fluorescence emission spectra of DNA/AgNCs with various concentrations oftargetmiRNA-21 and selectivity experimentoftheDNA/AgNCsprobeformiRNA-21detection

表1 在胎牛血清中的miRNA-21的回收率Tab 1 Recoveries of miRNA-21 in fetal bovine serum samples

2.4.1 環境pH值對DNA/AgNCs探針熒光性質的影響 研究中設置了pH值分別為3.0（a），5.0（b），7.4（c），9.0（d）和 11.0（e）的溶液環境體系。如圖 3 A所示，使用600 nm激發波長時，不同pH值溶液體系中探針材料的發射強度存在明顯差別。當溶液pH值為7.4時，其熒光強度最大。如圖3B所示，不同pH環境下的各組樣品在紫外-可見吸收光譜中存在相似規律，均在600 nm波長處存在吸收峰，pH值為7.4時吸收強度最大。這說明溶液的pH值影響探針熒光性質，因此在應用于檢測前需要對體系環境的酸堿度進行優化。

2.4.2 Mg2+對DNA/AgNCs探針熒光性質的影響 本研究體系中設置了 Mg2+濃度為 0，2，4，6，8，10 和12 mmol/L的溶液環境，研究Mg2+對探針DNA/AgNCs的熒光發射的影響。如圖4A所示，Mg2+濃度在2~6 mmol/L的范圍內比較理想，其濃度為4 mmol/L時熒光強度達到最大。對比加入和不加入Mg2+的探針DNA/AgNCs溶液的紫外光譜（圖4B），不含Mg2+的樣品只在400 nm有一處吸收峰[圖4B（a）]，而加入Mg2+的樣品，在430 nm和600 nm處出現吸收峰[圖4B（b）]。400 nm和430 nm處的吸收峰為大的銀顆粒吸收峰，600 nm處吸收峰為銀簇的吸收峰。

圖3 熒光發射光譜圖和紫外吸收光譜圖Fig 3 Fluorescence emission spectroscopy and UV absorption spectroscopy

圖4 熒光發射強度柱狀圖和紫外吸收光譜圖Fig 4 Fluorescence emission intensity histogram and UV absorption spectroscopy

3 討論

本研究通過構建以DNA作為模板合成的納米銀簇探針，借助探針與目標miRNA之間堿基互補配對引起的熒光信號變化，實現對miRNA-21的定性和定量檢測。根據表征結果，實驗合成的DNA/AgNCs在電鏡視野中以小尺寸、均一的納米粒子形態出現，在紫外光譜中600 nm處有最大吸收，并且以此波長激發有強的熒光發射。用于目標miRNA-21的檢測時，探針DNA/AgNCs的最佳熒光發射峰位和紫外-可見吸收峰位均發生改變，且核酸的二級結構也發生改變，這些結果表明探針DNA/AgNCs能夠用于目標物的定性分析。探針DNA/AgNCs熒光強度的變化與目標的濃度呈線性相關，說明此方法可以實現對目標的定量分析。探針DNA/AgNCs對miRNA-21的最低檢測限達到19.30 nmol/L，與其他文獻報道的檢測miRNAs的方法[8-9]相比，本文所設計的方法更靈敏且操作簡單。此外，實驗驗證這一方法對目標miRNA-21檢測有良好的特異性。在miRNA-21的血清回收實驗中，其平均回收率為93.0%～110.0%。綜上這些結果，此方法可以用于miRNA-21的定性和定量檢測分析。

為了實現檢測過程中穩定的光學性能，探針材料合成環境的優化是必要的。對溶液體系酸堿度的優化結果表明，pH值影響DNA/AgNCs的熒光性質。在酸性環境下，胞嘧啶會發生質子化，導致其與銀離子及銀簇之間的相互作用減弱，不利于熒光銀納米簇的生成和穩定；堿性環境下，Ag+與DNA上的磷酸基團形成Ag3PO4化合物[10]，導致與胞嘧啶相互作用的Ag+減少，不利于熒光銀納米簇的生成和穩定。所以，pH為7.4時是DNA/AgNCs材料發光的最佳環境。

Mg2+是人體必需的元素之一，其具有極其重要的生理生化功能。本文研究了Mg2+對探針DNA/AgNCs熒光性質的影響。結果顯示，加入Mg2+后DNA/AgNCs的吸收峰從400 nm單一吸收峰，變為430 nm和600 nm兩處吸收峰。由于400 nm附近的吸收通常認為來自于大的銀顆粒間共振能量轉移，600 nm處為銀簇吸收峰[11-12]，可以推斷Mg2+發揮的作用為減少體系中大粒徑銀顆粒的形成。

本課題應用新型材料探針DNA/AgNCs，實現了對miRNA-21的定性、定量檢測。同時對合成過程中的酸堿度和Mg2+環境進行了優化，為高效、敏感地檢測早期腫瘤潛在靶標miRNA提供思路。

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