IL-17A促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥的體外機(jī)制探討

徐靈靈，牛秀瓏，張宏健，李稚君，陳 燕，鄧為民

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070；2.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科，天津300162；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院輸血科，天津300052；4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津300052）

白介素17A（interleukin-17A,IL-17A）也叫IL-17，是IL-17家族的一個(gè)原型成員，IL-17家族包括6種細(xì)胞因子，IL-17A到IL-17F，包括5種受體，IL-17RA到IL-17RE[1-2]。IL-17A除了主要來(lái)源于輔助型T細(xì)胞17（T helper cell 17），也可來(lái)源于自然殺傷（NK）T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和先天免疫淋巴細(xì)胞[3-8]。卵巢癌（ovarian cancer，OVCA）是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，病死率居于首位。大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期。手術(shù)聯(lián)合化療、內(nèi)分泌治療是卵巢癌的主要治療手段，但化療耐藥性的產(chǎn)生使腫瘤的預(yù)后效果較差[9-11]。前期的研究結(jié)果表明IL-17A可加劇卵巢癌順鉑（cisplatin,DDP）耐藥性，增加DDP降低的A2780和OVCAR3細(xì)胞活性[12]。為進(jìn)一步探討IL-17A對(duì)卵巢癌化療耐藥性的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，本文旨在采用流式細(xì)胞術(shù)分析外源性重組人IL-17A（rhIL-17A）對(duì)卵巢癌細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化，為改善卵巢癌化療耐藥性提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人卵巢癌細(xì)胞系（A2780、OVCAR3）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，本實(shí)驗(yàn)室惠存；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；重組人IL-17A的中和抗體（rhIL-17RAmAb）購(gòu)自美國(guó)R&D公司；rhIL-17A購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；順鉑（CDDP or DDP）購(gòu)自中國(guó)齊魯醫(yī)藥公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A2780和OVCAR3細(xì)胞系用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，每1～2 d更換培養(yǎng)液并消化傳代，培養(yǎng)箱條件為37℃，CO2濃度5%，濕度95%。

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A2780和OVCAR3細(xì)胞接種于12孔板，每孔為1×105/1 mL，37℃二氧化碳孵箱孵育24 h后去掉培養(yǎng)基，加入5%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h使細(xì)胞同步化。先加入rhIL-17A（1 ng/mL），再加入順鉑（A2780：10 μmol/L；OVCAR3：100 μmol/L），同時(shí)用細(xì)胞因子稀釋液（0.1%BSA-PBS）和/或等量的生理鹽水（順鉑稀釋液）作為對(duì)照。分組如下：（1）control；（2）rhIL-17A 1 ng/mL；（3）DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）；（4）rhIL-17A 1 ng/mL+DDP 10 μmol/L （A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）；（5）rhIL-17A 1 ng/mL+DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）+IL-17RAmAb 3 μg/mL；（6）rhIL-17A 1 ng/mL+DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP100μmol/L（OVCAR3）+IL-17RAmIgG；先加入 IL-17RAmAb（3 μg/mL）預(yù)處理 1 h，然后再加入 rhIL-17A（1 ng/mL）或 DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）。37 ℃二氧化碳孵箱孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞。預(yù)冷0.1%BSA-PBS離心5 min后，洗2次。加入500 μL緩沖液混懸細(xì)胞。加入5μL Annexin V-FITC 混勻，再加入 5 μL 碘化丙啶（PI），混勻。避光室溫孵育10 min。1 h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)400目篩網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液備檢。設(shè)置波長(zhǎng)，收集細(xì)胞；Annexin V-FITC綠色熒光通過(guò)FITC通道（FL1）檢測(cè)；PI紅色熒光通過(guò)PI通道（FL2）檢測(cè)。同時(shí)將正常細(xì)胞（未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理）作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，以去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。CFlow Plus 1.0.264.15（BD AccuriC6）軟件分析結(jié)果[12]。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 細(xì)胞處理同細(xì)胞凋亡檢測(cè)。先加入rhIL-17A（1ng/mL），再加入順鉑（A2780：10 μmol/L；OVCAR3：100 μmol/L），同時(shí)用細(xì)胞因子稀釋液（0.1%BSA-PBS）和/或等量的生理鹽水（順鉑稀釋液）作為對(duì)照。分組如下：（1）control；（2）rhIL-17A 1 ng/mL；（3）DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）；（4）rhIL-17A 1 n g/mL+DDP 10 μ mol/L （A2780）/DDP 100 μ mol/L（OVCAR3）。培養(yǎng)結(jié)束后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞。預(yù)冷0.1%BSA-PBS離心5 min，洗2次。70%冰乙醇重懸細(xì)胞放于-20℃過(guò)夜。將過(guò)夜固定細(xì)胞離心去除乙醇，隨后沉淀中加入核糖核酸酶 A（RNase A；50 μg/mL），37℃水浴 30 min終止RNase A作用；再加入終濃度為0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、50 μg/mL 的 PI，避光 4 ℃孵育40 min。細(xì)胞經(jīng)400目篩網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液備檢。設(shè)置波長(zhǎng)。收集細(xì)胞，通過(guò)FL2通道檢測(cè)PI紅色熒光。CFlow Plus 1.0.264.15（BD Accuri C6）軟件分析結(jié)果，確定細(xì)胞周期分布[12]。

2 結(jié)果

2.1 rhIL-17A通過(guò)IL-17RA抑制DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，1 ng/mL rhIL-17A對(duì)A2780和OVCAR3細(xì)胞的凋亡水平無(wú)明顯影響；經(jīng)1 ng/mL rhIL-17A預(yù)處理24 h后，DDP對(duì)A2780和OVCAR3細(xì)胞的毒性作用明顯減弱，A2780細(xì)胞的凋亡率由（25.8±3.3）%降低為（15.0±0.8）%；OVCAR3細(xì)胞的凋亡率由（19.2±1.0）%降低為（11.7±1.9）%。以 IL-17RA mAb進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)可部分消除rhIL-17A對(duì)DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞凋亡的阻滯作用。上述結(jié)果提示，單獨(dú)外源性rhIL-17A作用不影響OVCA細(xì)胞的凋亡水平；外源性rhIL-17A可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DDP的耐受性。見圖1。

2.2 rhIL-17A能夠抑制DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞周期阻滯 與對(duì)照組相比，單獨(dú)rhIL-17A（1 ng/mL）作用對(duì)A2780和OVCAR3細(xì)胞的周期分布無(wú)明顯影響；DDP處理后，可使A2780和OVCAR3細(xì)胞的G0/G1期比例減少，G2+S期比例增加，說(shuō)明DDP可將細(xì)胞阻滯于G2期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖；但rhIL-17A預(yù)處理細(xì)胞2 h后，再加入DDP，可使A2780和OVCAR3細(xì)胞的G0/G1期比例增加，G2+S期比例減少，說(shuō)明rhIL-17A可抑制由DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制DDP的細(xì)胞毒性作用。見圖2。

圖1 rhIL-17 A對(duì)DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 The effect of cell apoptosis of rhIL-17A on A2780 and OVCAR3 cells treated with DDP

圖2 rhIL-17A對(duì)DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞周期分布變化的影響Fig 2 The effect of rhIL-17A on cell cycle changes of A2780 and OVCAR3 cells treated with DDP

3 討論

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率高，預(yù)后差[13]。目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以手術(shù)為主，輔以放化療的綜合方案，然而療效不是很理想，大部分患者治療達(dá)到臨床完全緩解后，會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此卵巢癌患者的5年生存率不到30%[13]。耐藥性的發(fā)生是影響卵巢癌治療效果的主要原因。順鉑是一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，以順鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療方案已經(jīng)應(yīng)用于多種腫瘤的綜合治療，包括卵巢癌、骨肉瘤、小細(xì)胞肺癌等。但固有性或獲得性順鉑耐藥的產(chǎn)生極大地影響了腫瘤化療的臨床效果。

IL-17A是一種多效性細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)炎性免疫反應(yīng)的生物學(xué)活性，是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要成分之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的作用。包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞可表達(dá)IL-17RA[12]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性IL-17A可通過(guò)IL-17RA直接作用于卵巢癌細(xì)胞，通過(guò)Gli1介導(dǎo)的Hedgehog（Hh）信號(hào)通路增加耐藥相關(guān)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒超家族G家族第2個(gè)成員（ATP-binding cassette super-family G member 2,ABCG2）和多藥耐藥蛋白（muti-drug resistance 1,MDR1）的表達(dá)水平，從而促進(jìn)OVCA的DDP耐藥，并可增加DDP降低的A2780和OVCAR3細(xì)胞活性[12]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用往往能夠改變細(xì)胞周期分布，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。為了進(jìn)一步探討IL-17A誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞DDP耐藥性的發(fā)生機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)組采用流式細(xì)胞術(shù)分析外源性rhIL-17A對(duì)卵巢癌細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表明rhIL-17A自身對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡沒有直接的影響，但與DDP共存時(shí)，可顯著降低DDP誘導(dǎo)的A2780和OVCAR3細(xì)胞凋亡，并且該效應(yīng)可被IL-17RAmAb部分消除。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，rhIL-17A自身對(duì)卵巢癌細(xì)胞的周期分布沒有直接影響，但加入DDP后，rhIL-17A可抑制由DDP造成的細(xì)胞周期阻滯，抑制DDP的細(xì)胞毒性作用。

綜上所述，外源性的rhIL-17A對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡及周期分布沒有直接的影響，但可通過(guò)IL-17RA抑制DDP所引起的卵巢癌細(xì)胞的凋亡及周期分布變化。

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