乳腺癌細胞MDA-MB-231誘導破骨細胞成熟方法研究

王碩

（天津醫科大學腫瘤醫院生物化學與分子生物學研究室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060）

在女性人群中乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，每年將近有160萬患者被確診為乳腺癌，其中30%～40%的乳腺癌患者會發生轉移，而超過90%死亡患者發生乳腺癌轉移[1]。骨是乳腺癌常見轉移器官，乳腺癌引發的骨轉移通常為溶骨性骨轉移[2]。骨組織由骨細胞、成骨細胞和破骨細胞構成[3]，骨細胞是骨組織中一大類細胞的總稱，參與調節骨組織機械敏感性；成骨細胞在骨微環境中參與骨基質的合成、分泌及礦化；破骨細胞參與骨基質的重吸收，與成骨細胞共同維持骨穩態的平衡[4]。在骨微環境中破骨細胞一旦被異常激活，骨穩態便遭到打破，進而引發溶骨性損傷[5]。因此，體外誘導破骨細胞分化成熟實驗具有重要作用，是體內乳腺癌骨轉移機制研究的基礎工作。雖然破骨細胞體外誘導成熟的基礎實驗方法已有報道[6-7]，但是有關乳腺癌細胞系MDAMB-231細胞條件培養基體外誘導破骨細胞成熟的研究卻鮮有報道。腫瘤細胞的培養上清液中所含有腫瘤細胞分泌因子通過腫瘤外分泌的方式與其它的細胞膜表面受體相結合，進而影響其作用以及功能。腫瘤細胞可以分泌很多細胞因子，例如TGFβ、VEGF、IGF-Ⅱ等，這些細胞因子經過外分泌的作用可通過信號轉導影響其它細胞的侵襲遷移能力、增殖能力、分化障礙、凋亡強弱等。同樣MDA-MB-231腫瘤細胞培養上清中含有很多種分泌因子，這些細胞因子是不是可以誘導小鼠破骨細胞成熟就成了研究的重點。筆者課題組前期研究發現，由于腫瘤細胞條件培養基成分復雜，乳腺癌細胞系MDAMB-231細胞條件培養基體外誘導破骨細胞成熟采用常規誘導方法通常容易導致炎癥反應的發生。因此，本文通過設計4組不同誘導方法，探究乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞條件培養基體外誘導破骨細胞分化成熟的最佳實驗條件，為腫瘤細胞條件培養基體外誘導破骨細胞分化成熟提供可靠實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明雌鼠10只（華阜康，北京），6～8 周齡（約 20 g）。

1.1.2 實驗細胞 乳腺癌細胞系MDA-MB-231購自美國標準生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），MDA-MB-231 細胞培養于含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的RPMI-1640培養基（Invitrogen公司）；所有細胞培養均加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，對數期細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.1.3 試劑 α-MEM基礎培養基，RPMI-1640基礎培養基和滅活胎牛血清購自美國Gibco公司；小鼠NF-κB受體激活子配體（RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）購自美國Peprotech公司；100×青霉素/鏈霉素混合液購自美國Invitrogen公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自美國Sigma公司；紅細胞裂解液（Tris-HCl，0.01mol/L，pH 7.4） 和 PBS （NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.083 g，KH2PO4·12H2O 0.261 g，pH7.2）。

1.2 方法

1.2.1 分離小鼠骨髓細胞 頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡小鼠全身3～5 min，無菌環境中分離小鼠脛骨和股骨。將分離得到的脛骨和股骨浸泡于37℃PBS中，分別剪去脛骨和股骨兩端，并用PBS沖洗骨髓腔，至骨髓腔發白，收集骨髓細胞，紅細胞裂解液破除骨髓腔中的紅細胞，收集剩余骨髓細胞。1.2.2 細胞計數 首先將計數板以及蓋玻片擦拭干凈，將蓋玻片蓋在計數板上；然后將細胞懸液吸出20 μL，滴加在蓋片邊緣，使細胞懸液充滿計數板與蓋玻片之間（蓋玻片與計數板之間不能有氣泡，也不可將細胞懸液流出）；最后將計數板靜止2～3 min后，計算計數板4大格細胞總數，壓線的細胞只計左側和上方的，公式計算：細胞數/mL=4大格細胞總數/4×104，公式中除以4，因為計數計的是4大格的細胞數。

1.2.3 實驗分組 A組：正常貼壁法分離24 h后未貼壁細胞，接種到12孔板，分別用30 ng/mL M-CSF處 理 3 d，30 ng/mL M-CSF，50 ng/mL RANKL 和20%MDA-MB-231細胞條件培養基聯合誘導7 d（每2 d換1次液）；4%多聚甲醛固定細胞，TRAP染色，鏡下觀察，統計TRAP陽性細胞數和直徑。B組：正常貼壁法分離24 h后未貼壁細胞，接種到12孔板，分別用30 ng/mL M-CSF處理3 d，30 ng/mL M-CSF和 50 ng/mL RANKL誘導 2 d，30 ng/mL M-CSF，50 ng/mL RANKL和 20%MDA-MB-231細胞條件培養基聯合誘導7 d（每2 d換1次液）；4%多聚甲醛固定細胞，TRAP染色，鏡下觀察，統計TRAP陽性細胞數和直徑。C組：貼壁前加入15ng/mL M-CSF，24 h后分離未貼壁細胞，接種到12孔板，分別用30 ng/mL M-CSF處理3 d，30 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL和20%MDA-MB-231細胞條件培養基聯合誘導7 d（每2 d換1次液）；4%多聚甲醛固定細胞，TRAP染色，鏡下觀察，統計TRAP陽性細胞數和直徑。D組：貼壁前加入15 ng/mL M-CSF，24 h后分離未貼壁細胞，接種到12孔板，分別用30 ng/mL M-CSF處理3 d，30 ng/mL M-CSF和 50 ng/mL RANKL 誘導 2 d，30 ng/mL M-CSF、50 ng/mL RANKL和20%MDA-MB-231細胞條件培養基聯合誘導7 d（每2 d換1次液）；4%多聚甲醛固定細胞，TRAP染色，鏡下觀察，統計TRAP陽性細胞數和直徑。

1.2.4 TRAP染色 TRAP染色步驟按Sigma試劑盒說明書進行，具體步驟如下：37℃預熱足夠的去離子水，向50 mL離心管中分別加入0.25 mL快速石榴型堿溶液和0.25 mL亞硝酸鹽溶液，輕輕混勻，室溫靜置2 min，加入0.25 mL萘酚AS-BI磷酸溶液，加入1 mL醋酸鹽溶液，加入22.5 mL去離子水（37℃），加入0.5 mL酒石酸鹽溶液，充分混勻，37℃水浴加熱（整個過程注意避光），棄細胞上清，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛37℃固定20 min，PBS洗滌2次，棄上清，加入配置的37℃染色液，37℃避光孵育1 h，去離子水充分洗滌，加入蘇木精溶液復染，自來水漂洗，晾干，顯微鏡觀察，統計TRAP陽性細胞數和直徑。

1.3 統計學分析 體外細胞學實驗每組3次重復實驗，每個實驗獨立重復至少2次。實驗數據采用±s表示，實驗組與對照組之間比較采用Student’s t檢驗。統計分析采用SPSS17.0統計軟件。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDA-MB-231 細胞條件培養基容易誘發破骨細胞在分化早期發生炎癥反應，采用正常貼壁法分離得到未貼壁骨髓細胞，用30 ng/mL M-CSF處理3 d后，直接采用20%MDA-MB-231細胞條件培養基、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL聯合誘導7 d（A組）；TRAP染色后鏡下觀察發現不但沒有成熟的破骨細胞形成反而發生嚴重的炎癥反應（圖1 A組）。此外，采用貼壁前加入15 ng/mL M-CSF貼壁分選分離得到的未貼壁骨髓細胞，用30 ng/mL M-CSF處理3 d后，再直接采用20%MDA-MB-231細胞上清、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL聯合誘導7 d，TRAP染色后鏡下觀察發現同樣沒有成熟的破骨細胞形成并且同樣有炎癥反應發生（圖1C組）。

圖1 A組和C組TRAP染色結果Fig 1 TRAP staining results of group A and group C

2.2RANKL和M-CSF聯合誘導后，MDA-MB-231細胞條件培養基能夠促進破骨細胞分化成熟 通過正常貼壁法分離得到的未貼壁細胞，通過30 ng/mL M-CSF處理3d后，采用30ng/mLM-CSF和50ng/mL RANKL誘導2 d，再采用20%MDA-MB-231細胞條件培養基、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL聯合誘導7 d；TRAP染色后發現能夠誘導出成熟的小鼠骨髓源性破骨細胞（圖2 B組）。與此相似的是，貼壁前加入15 ng/mL M-CSF貼壁分選分離得到的未貼壁骨髓細胞，通過30 ng/mL M-CSF處理3 d后，再采用30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL誘導2 d，最后采用20%MDA-MB-231細胞條件培養基、30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL聯合誘導7 d，TRAP染色后發現同樣能夠誘導出成熟的小鼠骨髓源性破骨細胞（圖2 D組）。

圖2 B組和D組TRAP染色結果Fig 2 TRAP staining results of group B and group D

2.3 貼壁前采用M-CSF刺激骨髓細胞能夠分選出更多具有活力的破骨前體細胞 為了探究M-CSF在貼壁分選骨髓腔細胞過程中的作用。通過比較正常貼壁法分離未貼壁骨髓細胞和貼壁前加入15 ng/mL M-CSF貼壁分選分離得到的未貼壁骨髓細胞兩種方法發現，在都能誘導出成熟破骨細胞前提下，采用貼壁前加入15 ng/mL M-CSF貼壁分選分離得到的未貼壁骨髓細胞能夠誘導出數量更多，體積更大的成熟破骨細胞（圖3）。

圖3 成熟破骨細胞相對數量和直徑統計Fig 3 The relative number of mature osteoclasts and diameter statistics

3 討論

骨是乳腺癌常見的遠處轉移器官，乳腺癌骨轉移主要導致溶骨性病變，嚴重影響患者生存質量和生存期[8]。體外誘導破骨細胞分化成熟實驗是乳腺癌溶骨性骨轉移研究的基礎。本研究以乳腺癌細胞MDA-MB-231條件培養基為對象，對乳腺癌細胞條件培養基誘導破骨細胞分化成熟實驗條件作了探究。同時發現在破骨細胞分化早期，乳腺癌細胞MDA-MB-231條件培養基容易引起單核細胞發生炎癥反應；在破骨細胞分化中后期，乳腺癌細胞MDA-MB-231條件培養基能夠促進破骨前體細胞分化成熟。

根據文獻報道，在破骨細胞分化成熟過程中，MCS-F和RANKL是兩種重要的細胞因子。M-CSF通過和細胞表面受體c-Fms相互作用[9]，抑制前體破骨細胞的凋亡、促進前體破骨細胞增殖[10]、促進破骨細胞表達RANK；RANKL通過和RANK相互作用，激活TNF受體相關因子6（TRAF6）和c-Fos信號通路，促進破骨細胞分化相關轉錄因子的表達[11-12]，最終促進破骨細胞分化成熟。破骨細胞體外誘導的研究方法已有很多文獻報道，但對于體外腫瘤細胞（尤其是骨轉移好發腫瘤）條件培養基誘導破骨細胞分化成熟的詳細研究方法卻鮮有報道。腫瘤細胞條件培養基是一個復雜的體系，包含各種細胞因子、受體、酶類及外泌體[13-14]等，因此，腫瘤細胞條件培養基誘導破骨細胞分化成熟的研究不同于普通的破骨細胞分化成熟研究。在破骨細胞分化早期，乳腺癌細胞MDA-M-231條件培養基容易引起炎癥反應，推測一方面是腫瘤細胞分泌大量炎癥因子，另一方面是分化早期的細胞是單核細胞，單核細胞極易發生炎癥反應，經RANKL和M-CSF誘導后單核細胞逐漸分化成前體破骨細胞，此時炎癥反應便不再容易發生，但其具體機制有待繼續研究。

本研究結果顯示RANKL和M-CSF聯合誘導后再用MDA-MB-231細胞上清刺激能夠促進破骨細胞分化成熟。因此，在破骨細胞分化成熟的早期，MDA-MB-231細胞條件培養基不但不具有促進其分化成熟的作用，反而容易引起單核細胞發生炎癥反應。貼壁前采用M-CSF刺激骨髓腔細胞能夠分選出更多具有活力的破骨前體細胞。乳腺癌細胞MDA-MB-231誘導小鼠骨髓源性破骨細胞分化成熟最佳條件是：15 ng/mL M-CSF處理貼壁分選前的骨髓細胞24 h后，用30 ng/mL M-CSF處理未貼壁骨髓單核細胞3 d，采用30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL誘導2 d，最后，采用20%MDA-MB-231細胞條件培養基、30 ng/mL M-CSF和 50 ng/mL RANKL聯合誘導7 d。

[1]Jin X,Mu P.Targeting breast cancer metastasis[J].Breast Cancer（Auckl）,2015,9（Suppl 1）：23

[2]Arrigoni C,Bersini S,Gilardi M,et al.In vitro Co-Culture models of breast cancer metastatic progression towards bone[J].Int J Mol Sci,2016,17(9)：1405

[3]Zhou J Z,Riquelme M A,Gu S,et al.Osteocytic connexin hemichannels suppress breast cancer growth and bone metastasis[J].Oncogene,2016,35(43)：5597

[4]Bartell S M,Kim H N,Ambrogini E,et al.FoxO proteins restrain osteoclastogenesis and bone resorption by attenuating H2O2accumulation[J].Nat Commun,2014,5：3773

[5]Morris E V,Edwards C M.Bone marrow adipose tissue：a new player in cancer metastasis to bone[J].Front Endocrinol(Lausanne),2016,7：90

[6]Lee J H,Kim B,Jin W J,et al.Trolox inhibits osteolytic bone metastasis of breast cancer through both PGE2-dependent and Independent mechanisms[J].Biochem Pharmacol,2014,91(1)：51

[7]Kim S D,Kim H N,Lee J H,et al.Trapidil,a platelet-derived growth factor antagonist,inhibits osteoclastogenesis by downregulating NFATc1 and suppresses bone loss in mice[J].Biochem Pharmacol,2013,86(6)：782

[8]Li X Q,Du X,Li D M,et al.ITGBL1 is a Runx2 transcriptional target and promotes breast cancer bone metastasis by activating the TGFβ signaling pathway[J].Cancer Res,2015,75(16)：3302

[9]Kim H J,Ohk B,Kang W Y,et al.Deficiency of lipocalin-2 promotes proliferation and differentiation of osteoclast precursors via regulation of c-Fms expression and nuclear factor-kappa B activation[J].J Bone Metab,2016,23(1)：8

[10]An J,Hao D,Zhang Q,et al.Natural products for treatment of bone erosive diseases：The effects and mechanisms on inhibiting osteoclastogenesis and bone resorption[J].Int Immunopharmacol,2016,36(36)：118

[11]Jin W J,Kim B,Kim J W,et al.Notch2 signaling promotes osteoclast resorption via activation of PYK2[J].Cell Signal,2016,28(5)：357

[12]Tanaka S,Nakamura K,Takahasi N,et al.Role of RANKL in physiological and pathological bone resorption and therapeutics targeting the RANKL-RANK signaling system[J].Immunol Rev,2005,208(208)：30

[13]Xiang X,Poliakov A,Liu C,et al.Induction of myeloid-derived suppressor cells by tumor exosomes[J].Int J Cancer,2009,124(11)：2621

[14]Keller S,K?nig A K,Marmé F,et al.Systemic presence and tumorgrowth promoting effect of ovarian carcinoma released exosomes[J].Cancer Lett,2009,278(1)：73