洋蔥皮不同溶劑提取物的體外抗氧化、 抑制α-糖苷酶活性研究

劉世馨,杜詠梅,侯小東,劉新民,付秋娟,張曉敬

(1.中國農業科學院煙草研究所,山東青島 266101;2.中國農業科學院研究生院,北京 100081)

洋蔥(AlliumcepaL.)是食用最廣泛的蔬菜之一,具有預防癌癥、抗氧化、降血脂、降血糖等多種保健功效[1]。除鮮食外,洋蔥還被加工成洋蔥粉、洋蔥醋、洋蔥黃酮膠囊等高附加值產品[2]。在洋蔥食用或產品加工過程中,洋蔥皮則作為廢棄物而浪費。

洋蔥皮含有豐富的黃酮、多酚類物質[3],其含量是內部鱗莖的2～6倍[3-5],槲皮素及其糖苷是洋蔥皮黃酮類化合物的主要成分[5],據Bhimanagouda S. Patil 報道,洋蔥皮槲皮素含量比洋蔥鱗莖高達5倍[6]。研究表明,洋蔥皮提取物具有較好的抗氧化[7]、減肥[8]、抗血栓[9]、抗炎癥作用[10]。Gawlik-Dziki等人將洋蔥皮槲皮素和多酚分別作為食品添加劑,提高了面包的抗氧化性[11],抑制胃癌細胞,預防消化道癌癥[12]。研究表明,植物多酚、黃酮類化合物具有較好的降血糖作用,通過抑制α-糖苷酶活性以延緩腸道糖類吸收是其降低餐后血糖的主要機制之一[13-14]。目前有關洋蔥皮提取物抑制α-糖苷酶活性的研究報道較少。

白明生等[15]研究了洋蔥皮總黃酮的超聲波提取工藝,陳佳等[16]研究了洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及其抗氧化特征,蔣少華等[17]比較了乙醇回流提取法、超聲提取法和微波提取法對洋蔥皮總黃酮的提取效果。目前,有關不同提取溶劑對洋蔥皮總黃酮、槲皮素的提取效果及其提取物抗氧化、抑制α-糖苷酶活性研究還未見報道。本研究以洋蔥皮為材料,研究不同溶劑對洋蔥皮總多酚、總黃酮、槲皮素的提取效果及其提取物抗氧化、抑制α-糖苷酶活性,為洋蔥資源的梯次高效利用及高附加值功能食品開發提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋蔥皮樣品 山東洋蔥食品加工廠;槲皮素對照品 純度95%,Adamas公司;維生素E(VE)對照品 純度97%，ALDRICH公司;1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽(ABTS) TCL公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ) 阿拉丁公司;吩嗪硫酸甲酯(PMS)、beta-煙酰胺腺嘌呤二核苷二鈉(NADH) SIGMA公司;氯化硝基四氮唑藍(NBT) BIOBEST公司;α-糖苷酶 來源于酵母,750U，SIGMA公司;阿卡波糖 純度95%，源葉生物公司;對-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG)、Folin-Ciocalteu 試劑 SIGMA公司;甲醇、醋酸 為色譜純;過硫酸鉀、NaNO2、AlCl3、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等 均為分析純。

BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;SBL-30DT超聲波恒溫清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;Re100-pro 旋蒸儀 SCILOGEX公司;Multiskan Fc酶標儀 Thermo賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統、UV檢測器 美國Waters公司;其他為實驗室常規設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 洋蔥皮提取方法 將紫洋蔥皮烘干粉碎至60目備用,參照文獻[18]分別精密稱取20 g粉末8份,按1∶12 (g/mL)比例加入石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、95%、80%、60%、40%乙醇和水,40 ℃超聲浸提20 min,抽濾,濾渣分別用200、180 mL上述溶劑重復提取2次,每次20 min,三次濾液合并,50 ℃減壓濃縮至干,稱取獲得提取物的質量,獲得的提取物用DMSO溶解,配制成質量濃度為2%的溶液,該溶液為提取物母液。

1.2.2 洋蔥皮提取物總多酚、總黃酮及槲皮素含量測定 根據相關化合物測定方法要求,將1.2.1獲得的洋蔥皮提取物母液分別用甲醇稀釋至適宜濃度,獲得總多酚、總黃酮及槲皮素待測液。

1.2.2.1 總多酚的測定 總多酚的測定采用Folin-Ciocalteu比色法,參照Singleton的方法[19],并做一些修改,以沒食子酸作標樣,繪制標準曲線。移取25 μL稀釋后的Folin-Ciocalteu試劑(用水稀釋10倍),分別加入25 μL 10～100 μg/mL的沒食子酸溶液,充分混勻后室溫反應5 min,依次加入100 μL蒸餾水和25 μL 20% Na2CO3溶液,充分混勻,黑暗條件室溫反應30 min,760 nm測定吸光度,每處理3次重復,得到沒食子酸質量濃度Y(μg/mL)與吸光度A的線性回歸方程為y=6.0088x+0.0171,R2=0.9969。根據回歸方程計算洋蔥皮提取物中總多酚含量,結果以沒食子酸當量表示,單位為mg/g,洋蔥皮提取物總多酚純度和提取率計算方法:

式中:M1表示提取物質量,單位為g,M表示稱取洋蔥皮粉末質量,單位為g。

1.2.2.2 總黃酮的測定 總黃酮的測定采用氯化鋁比色法,參照Jia,Zhishen的方法[20],以槲皮素作標樣,繪制標準曲線。吸取100 μL 0.066 mol/L的NaNO2于96孔板中,分別加入50 μL 100～800 μg/mL的槲皮素溶液,充分混勻后室溫反應5 min后,加入15 μL 10% AlCl3,充分混勻室溫反應6 min,最后加入100 μL 1 mol/L的NaOH終止反應,在510 nm測定吸光度,每處理3次重復,得到槲皮素質量濃度y(μg/mL)與吸光度A的線性回歸方程為y=2.0324x+0.0585,R2=0.9991。根據回歸方程計算提取物中總黃酮含量,結果以槲皮素當量表示,單位為mg/g,洋蔥皮提取物總黃酮純度及提取率計算方法與1.2.2.1同。

1.2.2.3 槲皮素的測定 洋蔥皮提取物槲皮素含量參照崔濤的方法[21],用液相色譜測定。稱取適量槲皮素對照品,配制成20、30、40、60、80 μg/mL的對照品工作溶液。提取物待測液過0.22 μm微孔濾膜,用液相色譜分離、檢測,外標法定量,每處理3次重復。洋蔥皮提取物槲皮素純度及提取率計算方法與1.2.2.1同。

液相色譜條件為:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)柱溫為35 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣體積為5 μL;流動相A為純甲醇,流動相B為含0.5%(V/V)醋酸水溶液;程序梯度為:0～2 min,35% A;2～4 min,35%～60% A;4～6 min,60%～80% A;6～8 min,80%～100% A;8～10 min,100%～80% A;10～12 min,80%～60% A;12～13 min,60%～35% A;檢測波長為370 nm。

1.2.3 洋蔥皮提取物體外抗氧化活性實驗 將1.2.1獲得的洋蔥皮不同溶劑提取物母液(濃度為2%)分別用甲醇稀釋,配制成濃度為20、40、80、100、200、400、800、1000 μg/mL的待測溶液。

1.2.3.1 總還原能力測定 總還原能力測定參考Ang,LZP的方法[22],準確吸取150 μL FRAP試劑于96微孔板中,加入50 μL不同濃度(20～1000 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液,反應10 min后在593 nm下測吸光值,以槲皮素甲醇溶液作陽性對照,50 μL甲醇代替樣品加入FRAP試劑中作空白對照,每個處理重復3次。還原力用樣品反應后的吸光值Ai表示。

1.2.3.2 DPPH·清除能力測定 DPPH·清除能力測定參考 Fabrizia Brisdelli的方法[23],吸取50 μL不同濃度(20～400 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液加入到150 μL 0.3 mmol/L DPPH·甲醇溶液中,混勻后于暗處30 ℃反應30 min,用酶標儀517 nm波長下測定吸光度值,以槲皮素/VE甲醇溶液作陽性對照,50 μL甲醇代替樣品加入到DPPH·甲醇溶液中作為空白對照,每個處理重復3次。DPPH·清除率按照以下公式進行計算:

式中:Ao為空白的吸光度值,Ai為樣品反應溶液的吸光度值。

IC50指待測樣品抑制率達到50%時對應的提取物濃度。其計算方法為:以待測樣品濃度為自變量(X),抑制率為因變量(Y),獲得待測樣品濃度與其清除DPPH·能力的關系線性方程,根據線性方程,計算待測樣品抑制率達到50%時對應的提取物濃度IC50值。

1.2.3.3 ABTS+·清除能力測定 ABTS+·清除能力測定參考Ang,LZP的方法[22],將1.1 mg/mL的ABTS+·甲醇溶液和0.68 mg/mL的過硫酸鉀水溶液等體積混合,暗室靜置過夜,制備ABTS+·工作液;調整吸光度0.7左右,取150 μL以上試劑于96孔板中,加入50 μL不同濃度(20～400 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液,室溫暗處反應30 min。用酶標儀734 nm波長測定吸光度。以槲皮素/VE甲醇溶液作陽性對照,50 μL甲醇代替樣品加入ABTS+·工作液中作為空白對照,每個處理做3次重復。ABTS+·清除率和IC50值計算方法與1.2.3.2相同。

1.2.4 洋蔥皮提取物抑制α-糖苷酶活性實驗α-糖苷酶抑制活性測定參照Masao Hattori的方法[25],并做調整。實驗分為對照空白組、對照反應組、樣品空白組和樣品反應組,在96孔板中進行加樣。依次加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH為6.8)、不同濃度(100～1000 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液和2.0 mmol/L PNPG底物,混合均勻,于37 ℃水浴保溫10 min,取出,加入37 ℃水浴的0.9 U/mL酶溶液,充分混勻,于37 ℃水浴反應20 min,加入150 μL 1.0 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應,405 nm測定吸光度,以槲皮素/阿卡波糖甲醇溶液作陽性對照,每處理3個重復。α-糖苷酶的IC50值計算方法與1.2.3.2相同。根據以下公式計算α-糖苷酶的抑制率:

式中:Ab為對照空白吸光度值,Ac為對照反應吸光度值,As為樣品空白吸光度值,Asb為樣品反應吸光度值。

1.3 數據分析

采用Excel和DPS 17.0軟件進行數據處理和統計分析,結果用平均值±SD表示,采用最小顯著差異法(LSD)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 洋蔥皮提取物總多酚、總黃酮、槲皮素的提取率及純度

由表1看出,石油醚提取物總多酚、總黃酮、槲皮素的提取率及純度均較低,乙酸乙酯提取物總多酚、總黃酮、槲皮素純度較高,但其提取率較低。水及乙醇溶液對洋蔥皮總多酚、總黃酮及槲皮素的提取率均顯著高于石油醚、乙酸乙酯,隨乙醇濃度升高,總多酚、總黃酮、槲皮素提取率及純度均呈先升高后降低趨勢,其中,60%乙醇提取物總多酚、總黃酮、槲皮素提取率最高,分別達5.5%、9.87%、3.25%,60%乙醇提取物總多酚、總黃酮的純度分別高達(33.12%±0.39%)、(59.44%±0.38%),均顯著高于水及其他濃度乙醇溶液提取物。綜合考慮不同溶劑對洋蔥皮總多酚、總黃酮、槲皮素提取率及純度,60%乙醇溶液效果最好。

表1 不同溶劑洋蔥皮提取物總多酚、總黃酮、槲皮素提取率和純度Table 1 The extraction rate and purity of the total polyphenols,total flavonoids and quercetin of different solvent onion peel extracts

2.2 洋蔥皮提取物體外抗氧化活性

2.2.1 總還原能力 由表2可見,在20～1000 μg/mL質量濃度范圍內,同一溶劑洋蔥皮提取物隨其質量濃度的增加,其還原能力呈逐漸增加趨勢(吸光度越大,還原能力越強)。在提取物質量濃度一致的情況下,隨乙醇濃度的增加,其總還原力呈先增加后降低的趨勢,其中40%～80%乙醇提取物總還原力顯著高于其他溶劑提取物。

表2 不同溶劑洋蔥皮提取物總還原力(A593)Table 2 Total reducing power absorbance of different solvent onion peel extracts(A593)

表3 不同溶劑洋蔥皮提取物DPPH·清除率及其IC50值Table 3 DPPH· scavenging rate and IC50 value of different solvent onion peel extracts

表4 不同溶劑洋蔥皮提取物ABTS+·清除率及其IC50值Table 4 ABTS+· scavenging rate and IC50 value of different solvent onion peel extracts

表5 不同溶劑洋蔥皮提取物清除率及其IC50值Table scavenging rate and IC50 value of different solvent onion peel extracts

2.3 洋蔥皮提取物抑制α-糖苷酶活性

由表6看出,在同樣質量濃度條件下,洋蔥皮不同溶劑提取物對α-糖苷酶活性抑制率均顯著高于同濃度的阿卡波糖(p<0.05),說明洋蔥皮提取物對α-糖苷酶具有較好的抑制作用。在100～1000 μg/mL質量濃度范圍內,同一溶劑洋蔥皮提取物隨著提取物質量濃度增加,其對α-糖苷酶活性抑制率逐漸增大。在提取物質量濃度一致的情況下,隨乙醇濃度增加,其提取物對α-糖苷酶活性抑制率呈先增高后降低趨勢,其中,40%、60%乙醇溶液提取物抑制α-糖苷酶活性IC50值顯著小于其他溶劑提取物(p<0.05),其IC50值分別為(329±3.12)、(364±2.72) μg/mL。當提取物質量濃度達到1000 μg/mL時,40%、60%乙醇溶液提取物對α-糖苷酶活性抑制率分別達84.4%、83.0%,與槲皮素對α-糖苷酶活性抑制率接近。

表6 不同溶劑洋蔥皮提取物α-糖苷酶活性抑制率及其IC50值Table 6 Inhibition rate of α-glucosidase activities and IC50 value of different solvent onion peel extracts

2.4 洋蔥皮提取物抗氧化、抑制α-糖苷酶活性與其總多酚、總黃酮、槲皮素含量的相關性分析

表7 洋蔥皮提取物的抗氧化、抑制α-糖苷酶活性與總多酚、總黃酮、槲皮素含量的相關性Table 7 The correlation between antioxidant,inhibition of α-glucosidase activities and contents of the total polyphenols,total flavonoids and quercetin of onion peel extracts

3 結論與討論

本研究分別以水、40%～100%乙醇溶液、乙酸乙酯、石油醚為溶劑提取洋蔥皮活性成分,綜合分析不同溶劑提取物總多酚、總黃酮及槲皮素的提取率和純度,以60%乙醇作為溶劑對洋蔥皮活性成分的提取效果最好。綜合考慮不同溶劑提取物對總多酚、總黃酮及槲皮素的提取率和純度以及其體外抗氧化、抑制α-糖苷酶活性,以60%乙醇作為溶劑最好。通過相關分析發現,不同溶劑提取物總黃酮、槲皮素含量與其抗氧化、抑制α-糖苷酶活性相關性均達極顯著水平,尤其槲皮素含量與提取物生物活性相關性最高。

根據研究結果,洋蔥皮60%乙醇溶液提取物中總多酚、總黃酮、槲皮素的含量(或純度)分別達33.1%、59.4%、19.7%,槲皮素屬于黃酮類化合物,因此,洋蔥皮乙醇提取物活性成分主要為多酚及黃酮類化合物,由于多酚及黃酮類化合物均具有酚羥基,二者含量的測定結果中可能存在交叉,從而使提取物中多酚、黃酮類物質總量的測定結果(達92.5%)可能比實際值偏高。當然,洋蔥皮還含有多糖等其他活性成分,下一步還需加強研究。

有大量研究表明總多酚和總黃酮是抗氧化活性的物質基礎,多酚和類黃酮含量較高的樣品顯示出更高的抗氧化活性[3],孫霽寒等[26]、劉曦等[18]、張偉等[27]研究表明豆腐柴、藍莓葉和黑莓籽提取物的抗氧化活性和總黃酮、總多酚含量有關。總黃酮和槲皮素的抗氧化作用更是受到人們的重視,枇杷葉、小麥胚芽中黃酮都有較好的清除自由基能力[28-29]。Myung-Hee Kim等[30]研究了洋蔥皮提取物的抗氧化和降糖活性。洋蔥皮富含黃酮類化合物,尤其槲皮素含量豐富,因此,洋蔥皮提取物可作為天然強抗氧化劑和α-糖苷酶抑制劑的來源。

王菲等[31]、陳海龍等[32]、韓強等[33]采用響應面法分別對金花葵花總黃酮、黃蜀葵花槲皮素、楊梅渣槲皮素的提取工藝進行了優化,Wiestaw Wiczkowski等[34]探討了洋蔥皮槲皮素及其衍生物的生物利用度,In Seong Choi等[35]利用酶水解法和納米模型高效回收了廢棄洋蔥皮中的黃酮槲皮素。為更好地利用洋蔥皮農業廢棄物資源,在本研究基礎上采用響應面法進一步將洋蔥皮總黃酮和槲皮素提取工藝優化,并進行純化,將純化后的產物進行應用性研究,為洋蔥保健食品和天然抗氧化劑的開發提供理論基礎。

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