超臨界CO2萃取阿薩伊油的 工藝優化及GC-MS分析

瞿 研,賀 成,張建軍,李 偉,王小花,王林元,*

(1.北京中醫藥大學中藥學院,北京,100029;2.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院,北京,100029;3.北京中醫藥大學中醫學院,北京,100029)

阿薩伊(A?aí)為棕櫚科植物阿薩伊棕櫚樹(EuterpeoleraceaeMart.)的新鮮果實,又名巴西莓,原產于南美地區[1],在巴西、秘魯、哥倫比亞、蘇里南等地使用非常廣泛[2],素有“紫色黃金”之稱。目前,我國廣東、香港、臺灣已有少量種植。阿薩伊營養豐富,當地居民常用來果腹,同時它也具有很高的藥用價值。有研究記載阿薩伊油在原產地可用來治療痢疾[3],由果皮研磨制成的果粉可用于治療皮膚潰瘍,種子經燒烘后可制成浸液,用于治療發燒。當地傳統醫學還用該植物治療糖尿病,脫發,出血,肝炎、黃疸等肝臟疾病,腎臟疾病,瘧疾,月經不調,經期疼痛和肌肉酸痛等[4]。

近10年來,阿薩伊由于良好的抗氧化能力而備受關注,以阿薩伊為原料的各類產品風靡全球。2013年阿薩伊由衛生部引入中國成為新資源食品[5]在我國使用。根據文獻[6]及預實驗結果,我們得知阿薩伊中油脂含量占絕大部分,同時富含花青素、原花青素等不穩定成分。目前國內外的研究均為使用有機溶劑法提取阿薩伊中的油脂類成分,該方法提取溫度較高,時間長,對阿薩伊油中的不飽和脂肪酸及花青素等成分易產生破壞。因此,本文選擇溫度較低的超臨界CO2流體萃取技術對阿薩伊油的提取工藝進行優化。前期我們已對阿薩伊油中甾醇類成分進行了分析,并建立了含量測定方法。為了更好地對阿薩伊進行系統的研究,本文采用GC-MS法對阿薩伊油進行了較為全面的定性分析,以期為阿薩伊的綜合開發利用及質量評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿薩伊凍干粉 蒙維(上海)貿易有限公司;14%三氟化硼-甲醇絡合物、石油醚(沸點為60～90 ℃)、正庚烷、甲醇、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、氯化鈉 均為分析純;二氧化碳 純度≥99.0%,北京環宇京輝京城氣體科技有限公司。

HA220-50-07型超臨界CO2萃取設備 南通市華安超臨界有限公司;Agilent 7890-5977B GC/MS型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;BT-125D型電子天平 北京塞多利斯儀器系統有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超臨界CO2萃取阿薩伊油條件優化

1.2.1.1 單因素實驗 將阿薩伊凍干粉混合均勻,固定每次投料量為100 g,設定萃取溫度為40 ℃,萃取時間60 min,分離釜Ⅰ壓力為8 MPa,溫度為35 ℃,分離釜Ⅱ壓力為4 MPa,溫度為33 ℃,考察不同的萃取壓力15、20、25、30、35 MPa對油脂得率的影響;設定萃取壓力為30 MPa,萃取時間60 min,分離釜Ⅰ壓力為8 MPa,溫度為35 ℃,分離釜Ⅱ壓力為4 MPa,溫度為33 ℃,考察不同的萃取溫度30、35、40、45、50 ℃對油脂得率的影響;設定萃取壓力為30 MPa,萃取溫度40 ℃,分離釜Ⅰ壓力為8 MPa,溫度為35 ℃,分離釜Ⅱ壓力為4 MPa,溫度為33 ℃,考察不同的萃取時間30、60、90、120、180 min對油脂得率的影響。按下式計算油脂得率。

油脂得率(%)=阿薩伊出油量(g)/阿薩伊凍干粉投料量(g)×100

1.2.1.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎上,確定合適的因素水平,以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間3個因素為考察因素,以油脂得率為考察指標,進行3因素3水平的正交實驗,確定最佳工藝組合并進行直觀分析與方差分析,在最優條件下進行驗證實驗。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 The table of levels and factors of L9(34)orthogonal experiment

1.2.2 GC-MS分析方法

1.2.2.1 供試品甲酯化處理 樣品的甲酯化采用AOAC法[7]。取阿薩伊油0.5 g置于50 mL錐形瓶中,加入6 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液,振蕩混勻,水浴回流直至油滴全部溶解,再加入14%三氟化硼-甲醇溶液7 mL,繼續回流30 min,繼續加入5 mL正庚烷,取下冷凝器,取出燒瓶,加入飽和氯化鈉溶液至錐形瓶頸部,靜置,待分層清晰后取上清液,用無水硫酸鈉脫水,作為分析試樣。

1.2.2.2 GC-MS條件 GC條件:HP-88(100 m×0.25 mm,0.2 μm)型彈性石英毛細管色譜柱;進樣口溫度為240 ℃;升溫程序:從100 ℃開始,保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,保持5 min,再以2 ℃/min升至240 ℃,保持10 min;載氣為高純度He,流速為1.0 mL/min;分流進樣,分流比為20∶1;進樣量1 μL;汽化室溫度為250 ℃。MS條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度為150 ℃,傳輸線溫度240 ℃;溶劑延時9.5 min;全掃描,掃描范圍m/z 45～450。采用Mass Hunter的“未知物分析”軟件對該數據進行定性分析。同時采用37種混合脂肪酸甲酯標準品對組分進行驗證。按峰面積歸一法進行定量分析,將每一個化合物色譜峰面積所占的相對分數作為各組成化合物的質量分數。

1.3 數據處理方法

采用SPSS 20.0單因素方差、多因素方差分析進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 萃取壓力對油脂得率的影響 由圖1可以看出隨著萃取壓力增大,油脂得率也隨之增加,但在25～35 MPa時油脂得率增加十分緩慢。萃取壓力對超臨界萃取效果有重要影響,超臨界流體的密度隨著壓力的增加而增大,從而提高了超臨界流體的溶解性能[8],但壓力增加到一定程度后,超臨界流體的可壓縮性變小,造成油脂得率增加緩慢[8],同時考慮到安全因素(該超臨界流體萃取裝置的最大萃取壓力為35 MPa)和設備成本,選擇20、25、30 MPa作為正交實驗中萃取壓力的三個水平。

圖1 萃取壓力對油脂得率的影響Fig.1 The effect of pressure on the extraction rate of A?aí oil

2.1.2 萃取溫度對油脂得率的影響 實驗結果如圖2所示,隨著萃取溫度升高,油脂得率呈現出先增長后下降的趨勢。萃取溫度作為超臨界CO2萃取過程的另一個重要參數,升高溫度對萃取得率有兩種不同的影響趨勢。一方面,溫度升高會使分子熱運動加劇,超臨界流體與萃取成分的接觸機會增加,同時溫度升高也使傳質速率提高,這些均有利于萃取;另一方面,溫度升高會導致超臨界流體密度降低,溶解能力下降,導致萃取率下降[9]。因此,當其它條件一定時,存在著一個相對平衡的萃取溫度范圍,結合實驗結果,同時考慮到不破壞阿薩伊中的花青素、原花青素等不穩定成分,選擇35、40、45 ℃作為正交實驗中萃取溫度的三個水平。

圖2 萃取溫度對油脂得率的影響Fig.2 The effect of temperature on the extraction rate of A?aí oil

2.1.3 萃取時間對油脂得率的影響 由圖3可以看出,隨著萃取時間的增加,油脂得率先緩慢增長后趨于平衡。從理論上講,萃取時間越長,萃取越完全。但同時會增加能耗,提高成本。另一方面,若萃取時間過短,導致萃取不完全,萃取率降低。實驗發現,當萃取時間大于90 min時,油脂得率幾乎不變。因此,選定30、60、90 min作為正交實驗中萃取時間的三個水平。

圖3 萃取時間對油脂得率的影響Fig.3 The effect of times on the extraction rate of A?aí oil

2.2 正交實驗設計結果與分析

根據單因素實驗結果,選取L9(34)正交表進行超臨界CO2流體萃取阿薩伊油正交實驗,結果見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2極差分析可知,各因素作用主次順序為C>A>B。最佳工藝為A2B3C3,即萃取壓力為25 MPa,萃取溫度為45 ℃,萃取時間90 min。但由于萃取溫度的2、3水平差距非常小,同時考慮到成本問題及保留阿薩伊凍干粉的活性成分,因此,選擇40 ℃作為最終萃取溫度。綜上,確定最佳提取工藝為A2B2C3,即萃取壓力為25 MPa,萃取溫度為40 ℃,萃取時間90 min，阿薩伊油得率為54.871%。

按優選的工藝進行驗證實驗,當各項參數達設定值時開始萃取,平行操作3次,出油率分別為54.802%、52.507%和53.625%,RSD值為2.139%,與正交結果相符,表明該工藝穩定可行。

2.3 阿薩伊油的組成分析

采用GC-MS技術對阿薩伊油進行檢測,得到阿薩伊油的總離子流圖(見圖4),所得質譜圖經計算機質譜數據庫NIST14檢索,確定了樣品中譜庫匹配得分>70的34個化合物。其結果見表3。

表3 阿薩伊油氣質聯用分析結果Table 3 The results of GC-MS analysis of A?aí oil

圖4 阿薩伊油的離子流圖Fig.4 Total ion chromatography of A?aí oil

由表3可知,阿薩伊油中成分主要為烷烴類、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸,另外,還含有少量的酮、醇等。

傳統的提取油脂類成分的方法,如索氏提取、有機溶劑萃取等,時間較長、產品純度不高,易殘留有害溶劑[10]。超臨界CO2流體萃取技術是以超臨界CO2流體為萃取劑,在臨界溫度與壓力條件下,從流體或固體物料中獲取分離組分的方法[11]。該技術提取率高、產品純度好、流程簡單,適合不穩定、易氧化的揮發性成分和脂溶性成分的提取分離,為有效成分的提取提供了更好的方法[12]。近年來,超臨界CO2流體萃取技術發展迅速,已廣泛應用于植物藥的提取。阿薩伊富含花青素、原花青素等不穩定成分[13],在光線、熱、氧氣等存在情況下易發生變化。因此,本文選用超臨界CO2流體萃取法提取阿薩伊油,不僅可以防止油類成分受到破壞,同時可以最大限度的確保對其它成分的分析利用。

脂肪酸分為飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。營養學和生物臨床醫學研究認為,脂肪酸在維持人體健康方面起著重要的作用,飲食中長鏈脂肪酸的組成及含量與各種疾病(如腫瘤、冠心病、心腦血管病和老年癡呆癥等)的發病率呈正相關性[14-16]。因此,脂肪酸的組成和含量也就成為衡量其營養價值的最重要指標。從膳食中脂肪酸的平衡角度來說,中國營養學會建議,食用油脂中飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)的比例以1∶1∶1為宜,日本的推薦標準是3∶4∶3。對于多不飽和脂肪酸中w-6型和w-3型脂肪酸的比例,營養學家提出,小于4∶1的理想比值是有益于保障人體健康的脂肪酸平衡模式[17]。ω-3脂肪酸具有防止動脈硬化,降低血壓,活化大腦細胞,防止老年癡呆病等優點,當ω-6脂肪酸相對于ω-3脂肪酸過多時,會合成人體的炎癥因子[18]。實驗結果表明,阿薩伊中主要成分為油酸、棕櫚酸、亞油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸,相對百分含量分別為43.419%、19.028%、14.328%、6.702%、6.123%、2.067%,占總含量的92.855%。其中棕櫚酸、硬脂酸為飽和脂肪酸,棕櫚油酸、油酸為單不飽和脂肪酸,亞麻酸為ω-3型多不飽和脂肪酸,亞油酸為ω-6型多不飽和脂肪酸。具體見表4。其飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸的構成比例為0.49∶1∶0.31。ω-6型與ω-3型多不飽和脂肪酸比例為6.93∶1,基本符合膳食平衡標準。

表4 阿薩伊油中脂肪酸的分類Table 4 The classification of fatty acids in A?aí

橄欖油由于營養成分豐富、保健功能突出而被公認為綠色保健食用油,具有預防心腦血管疾病、糖尿病、防癌、抗衰老等功能,在西方有“植物油皇后”“液體黃金”之美稱。油茶籽油是我國特有的一種高級食用油,享有“油中珍品”的美稱。它富含單不飽和脂肪酸,其脂肪酸組成與橄欖油相似,有“東方橄欖油”之稱[19]。根據文獻統計[20],橄欖油與油茶籽油的主要成分見表5。與這兩種油相比,阿薩伊油中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸比例更加均衡,其亞麻酸含量較橄欖油及油茶籽油偏高,更加有利于人體健康。

表5 橄欖油、油茶籽油及阿薩伊油的組成對比Table 5 The composition of olive oil，camellia seed oil and A?aí oil

3 結論

超臨界CO2流體萃取阿薩伊油的最佳提取工藝為萃取壓力為25 MPa,萃取溫度為40 ℃,萃取時間90 min,此時得率為54.871%。

經GC-MS分析,阿薩伊油中共分離鑒定出34種化合物,其中含量較高的為油酸、棕櫚酸、亞油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸,質量分數分別為44.607%、19.028%、14.328%、6.702%、6.123%、2.067%。

阿薩伊作為一種南美常用草藥,是一種純天然的藥食兩用資源,可應用于食品、醫藥、添加劑等領域[13],符合現代的消費理念、營養需求及發展趨勢。本研究對阿薩伊的油脂類成分進行了較為系統的研究,為阿薩伊的綜合開發利用及質量評價提供了理論依據,為后期藥效實驗的開展及探討成分與藥效的相關性奠定基礎。

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