壓力水平及氯化鈉濃度對兔肌球蛋白 凝膠保水性及其膠凝過程中 理化特性和結構變化的影響

錢 暢,薛思雯,徐幸蓮,周光宏

(南京農業大學動物健康與食品安全國際實驗室，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，肉品加工農業部重點實驗室，肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心,江蘇南京 210095)

超高壓加工(High-pressure processing,HPP)技術作為近幾十年興起的非熱加工技術之一,已廣泛應用于食品行業。較傳統技術而言,其滅菌鈍酶效果更好,還可以最大程度地保持產品的風味與色澤[1]。隨著近年來相關研究的不斷深入,人們發現HPP對蛋白還存在修飾作用,可以改變蛋白分子的空間構象并引起其理化特性的變化。而畜禽肉作為高蛋白食品,在合適的參數下對其進行高壓處理能夠顯著改善產品的保水性和質構等凝膠特性[2-3]。其中最主要且唯一能成膠的肌球蛋白在此過程中的重要性不言而喻[4]。有研究[5]顯示在非變性溫度下對肌球蛋白進行高壓處理有利于其進一步變性與聚集,但同時參數上的細微變化也會對形成的凝膠的功能特性產生顯著影響,Xue等[6]的研究顯示300 MPa的高壓處理會使肌球蛋白過度變性,Iwasaki等[7]也發現200 MPa以上的高壓處理會壓縮肌球蛋白分子的體積,導致凝膠強度和表面彈性下降。因此研究高壓處理對肌球蛋白的影響將有助于該技術在肉品加工領域的合理應用。

凝膠類肉制品中的食鹽除調味防腐外,主要起促進蛋白溶解的作用。但過量攝入食鹽會誘發高血壓和多種心血管疾病[8],因此如何有效降低肉制品中的食鹽添加量成了目前行業亟需解決的問題之一。許多學者發現高壓處理可以在不改變或提高蛋白的功能特性的前提下,減少氯化鈉或磷酸鹽的添加量,即高壓可以促進肌原纖維的斷裂與蛋白的溶解,改變其分子空間構象并促進交聯[9-10]。然而在非變性溫度下經高壓處理后的蛋白在后續升溫過程中理化特性的變化尚不清晰,且該條件下氯化鈉濃度對蛋白的影響也鮮有研究。

本文通過研究不同氯化鈉濃度的兔肉肌球蛋白在非變性溫度下經高壓處理后,在后續升溫過程中理化特性與凝膠保水性的變化,確定較優的壓力水平與氯化鈉濃度,探討其機理變化,從而為低鹽功能性凝膠肉制品的開發及相關企業更好地利用HPP技術提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3月齡新西蘭白兔(2.5～3.0 kg) 江蘇省農科院畜牧所;腺苷-5′-三磷酸二鈉鹽(ATP)純度≥99%,二硫蘇糖醇(DTT)純度≥99.5% 美國Sigma公司;氯化鈉、焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、戊二醛(25%)、無水乙醇、叔丁醇等均為分析純 南京化學試劑有限公司;5,5-二硫代雙(DTNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)等均為分析純 上海阿拉丁公司。

Waring高速組織搗碎機 美國思伯明設備有限公司;Ultra Turrax T25高速勻漿器 德國IKA公司;Avanti J-E高速冷凍離心機 美國貝克曼有限公司;MicroMR微型核磁共振成像儀 上海紐邁電子有限公司;S-3000N掃描電鏡 日本日立公司;MCR 301流變儀 奧地利Physica公司;Spectra Max M2酶標儀 美國分子設備有限公司;圓二色譜儀 英國Applied Physics有限公司;聚乙烯真空包裝袋 20 ℃透氧率為1 cm3/(m2·h)，南京瑞翼特生物科技有限公司;S-IL-100-850-9-W高壓設備 英國Stansted Fluid Power公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌球蛋白的提取 健康的新西蘭雄性白兔,宰前提供飲水和充分休息,減少應激。

機械擊昏后切斷頸部血管放血,迅速剝皮,去頭,爪及內臟,自來水沖洗去除血跡。瀝干后放入冰箱(4 ℃)15 min后取腰大肌并剔除可見脂肪及結締組織,切碎稱重。參照Cao等[11]的操作于0～4 ℃下提取肌球蛋白,用雙縮脲法檢測肌球蛋白濃度。最后用不同濃度的氯化鈉溶液(m/m,1.0%、1.5%、2.0%)將蛋白濃度調至20 mg/mL,并在相應濃度的氯化鈉溶液中透析(20 h),期間每7 h更換1次透析液,共換3次。

1.2.2 高壓處理及肌球蛋白凝膠制備過程 將透析后的肌球蛋白溶液轉移至真空包裝袋中并封裝(每袋約50 g,去除氣泡),置于超高壓腔體中,在壓力100、200和300 MPa下保壓9 min,腔體溫度為25 ℃,分別取高壓處理后的肌球蛋白溶液于10 mL離心管、10 mL玻璃燒杯及玻璃小管(直徑15 mm)中,并置于水浴鍋中從20 ℃程序升溫(1 ℃/min)至85 ℃,保溫20 min。將凝膠置于0～4 ℃下過夜(12 h)。進行保水性,水分分布及凝膠微觀結構的測試。

1.2.3 保水性測試 保水性參照Kocher等[12]的方法,并做適當改動。準確稱量加入蛋白溶液前的離心管重量(W1)及加入蛋白溶液后的總重(W2)。凝膠制備完成后將離心管兩兩配平,經8000×g(4 ℃)離心10 min后取出去除水分,準確稱量余下重量(W3)。

保水性(%)=(W3-W1)/(W2-W1)×100

1.2.4 NMR自旋-自旋弛豫時間(T2)測試 低場核磁測量參照Han等[13]的方法,并略做改動。測試條件為:質子共振頻率為22.6 MHz,測量溫度為 32 ℃。取2 g凝膠樣品(15 mm玻璃小管中)放入核磁管再置于分析儀中。用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列進行測量。所使用τ值為350 μs,重復掃描32次,間隔時間為7000 ms,得到12000個回波峰點數。利用儀器自帶的Multi Exp Inv Analysis軟件進行反演,得到T2值及對應的峰面積所占的比例(PT2)。

1.2.5 掃描電鏡測試 測試用凝膠樣品的準備參照徐幸蓮等[14]的方法,用4%的戊二醛溶液(由25%的戊二醛溶液用相應濃度的氯化鈉溶液稀釋而得,v/v)固定48 h,用雙面刀片切成均勻小塊(3 mm×3 mm×2 mm),再用不同濃度的乙醇(50%、70%、90%、95%、100%)進行梯度脫水,放入叔丁醇中置換3次,每次30 min,再將其冷凍干燥并噴金(10 nm)。后利用掃描電鏡進行觀察,加速電壓為10 kV,每個樣品觀察8個區域。

1.2.6 流變特性測定 流變特性的測定參照Chen等[15]的方法,將肌球蛋白溶液用相應濃度的氯化鈉溶液稀釋至5 mg/mL。儀器采用平行板(上板直徑50 mm),參數設置如下:頻率為0.1 Hz,應變為0.01,狹縫為0.5 mm,升溫條件從20～80 ℃(1 ℃/min),記錄G′(貯能模量)的變化情況。

1.2.7 表面疏水性測定 參照Chen等[15]的方法并做適當修改,以ANS為熒光探針測定蛋白升溫過程中的表面疏水性變化。將蛋白溶液用相應濃度的氯化鈉溶液稀釋至1 mg/mL,各取4 mL 稀釋蛋白液加入10 mL離心管中,每組處理含15個樣品,用于25、40、55、70、85 ℃下的表面疏水性測定。將樣品置于水浴鍋中,從20～85 ℃程序升溫(1 ℃/min),并在五個特定溫度下保溫5 min,后將對應的樣品取出冰浴,防止溫度對蛋白的進一步影響。向冷卻后的蛋白液中加入20 μL ANS溶液(15 mmol/L 溶解于0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液,pH7.0)。室溫下反應20 min后使用酶標儀檢測激發波長為375 nm,發射波長為470 nm條件下的熒光強度。

1.2.8 活性巰基含量測定 參照Ellman[16]的方法并做適當修改,利用DTNB測定蛋白升溫過程中的活性巰基含量變化,蛋白溶液樣品準備及升溫過程同表面疏水性測定。向冷卻后的蛋白液中加入20 μL DTNB溶液(10 mmol/L 溶解于0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液,pH7.0)。混勻后在暗處反應1 h(4 ℃),取上清液并用酶標儀測定其在412 nm處的吸光值,并按以下公式計算蛋白中活性巰基的含量。

活性巰基含量C0(μmol/100 mg)=[(A/ε)·D]/C

其中:C0-巰基的摩爾濃度(μmol/100 mg);A-吸光值;ε-吸光系數13600 L×(mol×cm)-1;D-稀釋倍數;C-肌球蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.9 蛋白質二級結構測定 參照薛思雯等[17]的方法,測定蛋白質在升溫過程中二級結構的變化。將蛋白溶液用相應的氯化鈉溶液稀釋至0.3 mg/mL,在200～260 nm波長下測量分子橢圓率,采用20～90 ℃程序升溫(1 ℃/min),計算25、40、55、70、85 ℃下肌球蛋白分子二級結構(α-螺旋,β-折疊,β-轉角以及無規則卷曲)的含量,并以百分數形式表示。

1.3 數據統計

實驗采用3×3雙因素完全隨機設計,壓力水平和氯化鈉濃度兩個因素各設3個水平,以含2%氯化鈉的未經高壓處理的肌球蛋白作為對照。保水性、T2弛豫時間、表面疏水性以及活性巰基含量等指標的測量均重復三次,其結果以平均值±標準差表示。結果用SAS V8統計軟件進行數據分析,壓力水平及氯化鈉濃度對其余變量的主效應和互作效應采用混合模型方差分析,最小二乘均數間的成對差異用多重比較(Bonferroni t-test)進行事后檢驗,當p<0.05時表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 壓力水平、氯化鈉濃度及兩者間的交互作用情況

壓力水平、氯化鈉濃度及兩者間的交互作用對經高壓處理的兔骨骼肌肌球蛋白升溫過程中的三級結構以及形成熱凝膠的水分特征(凝膠保水性、凝膠中水分的弛豫時間和峰面積占比、五個特定溫度下的蛋白表面疏水性和活性巰基含量)的影響差異性情況分析見表1。由表1可知,壓力水平、氯化鈉濃度以及兩者間的交互作用對除了凝膠中結合水的T2弛豫時間的峰面積占比(PT2b)以外的其他指標均有極顯著影響(p<0.01),對PT2b則有顯著影響(p<0.05)。這與Villamonte等學者的研究結果[18]相似,說明壓力水平和體系中氯化鈉濃度的變化均會改變高壓肌球蛋白的結構,影響其在加熱過程中形成的凝膠基質中的水分分布,從而導致最終凝膠保水性的變化。而作為緊密結合在蛋白親水基團上的最內層水分[19],結合水的含量在此過程中的變化幅度或許小于另外兩種水分,且其占比較低。因此主效應及其交互作用對PT2b的影響的顯著性水平相對較高。

表1 壓力水平、氯化鈉濃度及其交互作用對經高壓處理的 兔骨骼肌肌球蛋白升溫過程中的三級結構以及形成熱凝膠的水分特征的影響Table 1 Effects of pressure levels,sodium chloride content and their interaction on the tertiary structures of rabbit myosin and water characteristics of formed gel during heating

2.2 保水性

圖1顯示的是壓力水平和氯化鈉濃度對高壓肌球蛋白凝膠保水性的影響情況。從圖1可以看出,經100或200 MPa 高壓處理的蛋白經加熱后形成的凝膠的保水性較對照組有顯著提升(p<0.05),而在300 MPa下,凝膠的保水性則顯著下降(p<0.05)。這與曹瑩瑩等[20]的發現相一致。蛋白凝膠的保水性與蛋白在體系中的溶解情況,蛋白與水之間的作用力以及形成的凝膠三維網絡結構等因素息息相關[13]。有研究顯示,適當的高壓處理可以改變蛋白空間構象,重排分子間相互作用并強化基團的親水性,使蛋白與水的結合能力增強,加熱后形成的致密凝膠基質也會容納更多的水分子[21]。而過高的壓力則會使蛋白過度變性,導致其溶解度下降,從而影響蛋白的成膠能力及形成的凝膠網絡結構,其保水性也隨之變差[6]。

圖1 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后加熱形成的凝膠保水性的變化Fig.1 Changes in water holding capacity of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels注:不同小寫字母表示同一指標不同處理間有 顯著性差異(p<0.05),相同小寫字母表示同一指標 不同處理間無顯著性差異(p>0.05)。

肌球蛋白作為一種鹽溶蛋白,體系中氯化鈉濃度的升高不僅可以促進其溶解,更能通過增強分子間靜電斥力的方式加劇其解折疊及結構的擴張,從而提高其熱誘導凝膠的保水性[22]。但在本研究中,100及200 MPa處理組的蛋白凝膠的保水性隨氯化鈉濃度的升高無顯著變化(p>0.05)。這可能是經高壓修飾的肌球蛋白的性質發生變化所致。肌球蛋白在氯化鈉濃度達到2% 或以上的溶液體系中一般可完全溶解[23],但100或200 MPa的高壓處理已使蛋白的空間構象發生變化,蛋白-蛋白,蛋白-水之間的相互作用也發生了改變,因此推測蛋白在氯化鈉濃度為1%的體系中已可完全溶解。此時氯化鈉濃度的升高并不會促進蛋白的溶解,故凝膠的保水性基本不變。而在300 MPa下,隨著氯化鈉濃度的升高,蛋白凝膠的保水性又呈上升趨勢。這可能是由于離子強度的提高使因過度變性而下降的蛋白溶解度再次升高[24],且增大了蛋白分子間的距離,加熱后形成的凝膠結構擴張并包裹住更多的水分[25],凝膠的保水性也隨之升高。

2.3 低場NMR T2弛豫時間

作為一種快速無損檢測技術,低場核磁共振(low-field NMR)可以通過觀察水分中氫質子的流動與分布,探測凝膠結構中的水分動態分布情況[26]。通過對CPMG序列得到的衰減曲線進行多指數擬合,發現蛋白凝膠中水分的T2弛豫時間在1～10000 ms內存在3個峰,按照其值的大小可能分別對應結合水(T2b)、不易流動水(T21)以及自由水(T22),而對應的指數分布PT2b、PT21、PT22則分別代表著它們所占的比例。從圖2可以看出,與其他處理組相比,經300 MPa處理后的蛋白形成的凝膠中水分的T2b、T21和T22值均顯著上升(p<0.05),說明凝膠中保持水分的毛細作用力減弱了[13],這可能是由于該壓力水平下蛋白凝膠結構的孔徑增大了,導致其束縛水分的能力下降[27]。但相應地,孔徑的增大也會使凝膠網絡結構中可以容納的水分更多。Xue等人[28]的研究顯示過高的壓力水平會影響蛋白形成的凝膠結構,從而使不易流動水向自由水轉化,PT21的顯著下降以及PT22的上升(p<0.05)也證實了這點。有研究[29]顯示PT21的大小與凝膠保水性間存在高度相關性,這也部分解釋了300 MPa下保水性的下降。

圖2 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后加熱形成的凝膠中水分弛豫時間的變化Fig.2 Changes in water relaxation time of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels注:不同小寫字母表示同一指標不同處理間 顯著性差異(p<0.05),圖3、圖6～圖8同。其中100-1% 代表經100 MPa高壓處理的含1%氯化鈉的蛋白處理組，以此類推。其他圖標涉及處類同。

在100或200 MPa下,含1% 或1.5% 氯化鈉的蛋白形成的凝膠的T21值顯著低于對照組(p<0.05),而T22值呈現先升高后降低的變化趨勢,說明此時壓力和氯化鈉濃度的交互作用會使凝膠結構的束水能力得到提升。但當氯化鈉濃度升高到2%時,T21和T22值均顯著增大(p<0.05),這可能是由于體系離子強度的變化影響了蛋白的結構及分子間的相互作用,帶電基團的數目和分布也隨之改變,導致水分子所受的斥力變大,不易流動水和自由水的流動性也增強了。

圖3 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后加熱形成的凝膠中水分峰面積占比的變化Fig.3 Changes in peak areas of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels

但同時PT21卻顯著降低而PT22則隨之升高(p<0.05),說明此時存在著由自由水向不易流動水的遷移,這也許在一定程度上彌補了流動性增強可能帶來的水分損失,故保水性沒有發生顯著變化。

2.4 凝膠微觀結構

凝膠功能特性的優劣受其微觀結構的影響較大,對凝膠三維網絡結構,孔洞大小以及蛋白的交聯特性的分析有助于對凝膠形成過程的研究[13]。圖4是利用掃描電鏡觀察的經高壓處理后的肌球蛋白溶液加熱形成的凝膠的微觀結構,可以看出,對照組的蛋白形成的凝膠表面較粗糙,多有不規則或斷裂的細絲,且蛋白聚集分布不均,這可能與肌球蛋白不能完全溶解有關。而經100 MPa 高壓處理后的凝膠由許多有序的絲狀鏈接組成,具有連續的網絡結構,其表面較光滑,孔洞的大小及分布也較為均勻。在200 MPa下,這些細絲的聚集程度加強了,但凝膠的多孔性卻有所下降,這與Wang等[30]觀察到的相一致,可能是由于蛋白間的相互作用加強所致。當壓力水平升高到300 MPa時,原本致密均一的絲狀結構消失了,取而代之的是由蛋白球狀聚集體組成的無序結構,其孔洞形狀不規則且大小不一。Van等[31]的研究顯示此時蛋白側鏈基團的活性增加,疏水作用和巰基的增強促進了更多分子內交聯的形成,加速了蛋白的聚集并導致蛋白與水間相互作用的減弱。因此凝膠的保水性降低。

圖4 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后加熱形成的凝膠微觀結構的變化Fig.4 Changes in microstructure of heat-induced gels formed by myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels注:A:對照;B:100-1%;C:100-1.5%;D:100-2%;E:200-1%;F:200-1.5%;G:200-2%;H:300-1%;I:300-1.5%;J:300-2%。

除了壓力水平,氯化鈉濃度的變化同樣也會使經高壓處理的蛋白加熱后形成的凝膠的微觀結構發生改變。在100 MPa下,當氯化鈉濃度從1%升高到1.5%時,凝膠中的絲狀網絡結構消失,其表面出現層狀分布的蛋白聚集。隨著氯化鈉濃度進一步升高到2%,蛋白聚集的程度不斷加劇,并開始形成立體結構。200 MPa各處理組的情況與100 MPa各組相似,但含2%氯化鈉的蛋白經加熱后形成的凝膠是由均勻顆粒交聯形成的三維網絡,其凝膠結構致密有序,多孔性好。經300 MPa處理的含2%氯化鈉的凝膠表面出現層狀聚集,且小孔的分布更為均勻,這也導致了其保水性的上升。肌球蛋白在離子強度不同的環境下會形成完全不同的凝膠結構,低離子強度(0.25 mol/L)下會形成細絲網狀三維凝膠結構,而在高離子強度(0.6 mol/L)下由于鹽溶效應,纖絲會解離成單體,最終形成球狀顆粒凝聚的凝膠立體結構[14]。這在經高壓處理的肌球蛋白體系中依然存在,但由于高壓處理的促溶作用,這種變化所需的離子強度也許降低了,且隨著壓力水平的變化而變化,但添加適量的鹽使蛋白完全溶出仍是肌球蛋白在超高壓條件下形成較好凝膠的必要條件[32]。

2.5 蛋白流變特性

蛋白在加熱過程中的流變特性變化可以較全面的反映其在逐步變性與成膠過程中的狀態[33]。圖5是經高壓處理后的肌球蛋白溶液(5 mg/mL)在20～80 ℃條件下的貯能模量(G′)的變化情況。可以看出,經100 MPa處理后的蛋白的貯能模量在40～55 ℃的升溫區間內的增長幅度顯著高于對照組,且其頭部變性峰的峰值與最終的G′值也較高,說明100 MPa的高壓處理能夠促進蛋白在初始加熱階段的頭-頭交聯并有助于最終凝膠網絡的形成。隨著壓力水平升高到200 MPa,蛋白頭部變性峰的峰值與峰值出現的溫度均有所降低,這說明蛋白頭部的聚集能力有了一定程度的下降且蛋白尾部的熱敏性上升,有研究顯示蛋白在弱凝膠形成階段(43～57 ℃)頭部聚集能力的適當下降有利于后續升溫過程中的尾-尾交聯[30]。而尾部熱敏性的提高也會促進其在加熱過程的展開與進一步交聯,這也許是200-1%組的蛋白的最終G′值高于100-1%組的原因之一。300 MPa各處理組的蛋白在升溫過程中未表現出弱凝膠形成階段,且300-1%組的蛋白在加熱前的初始G′值最高,可能是由于之前的高壓處理已經使蛋白變性并產生了一定程度的聚集與交聯[34],而蛋白的過早聚集也導致其在后續升溫過程中貯能模量的變化幅度較低,不能形成彈性良好的凝膠。

圖5 不同氯化鈉含量的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后在加熱過程中貯能模量的變化Fig.5 Changes in storage modulus of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating

氯化鈉濃度為1%的各處理組蛋白的貯能模量在頭部變性峰出現后開始降低,這主要是由于肌球蛋白的尾部變性展開,形成的弱凝膠結構被破壞[35]。有學者認為此時蛋白分子間相互作用的減弱會促進肌球蛋白聚集前的展開,從而有助于之后升溫過程中的蛋白交聯與凝膠網絡的形成[6]。但隨著氯化鈉濃度的升高,這一過程消失了,這可能是由于離子強度的變化影響了蛋白間的相互作用,蛋白尾部的變性以及構象的變化被抑制,包埋基團的暴露程度降低,蛋白分子內或分子間的疏水作用和二硫鍵減少,從而導致蛋白交聯減少減弱以及最終貯能模量的下降。前人的研究[14]也顯示蛋白在低離子強度下的絲狀結構可能更利于交聯的形成,故最終形成的凝膠結構更為有序。因此,經100或200 MPa處理的蛋白在1%的氯化鈉濃度下形成的凝膠性質更為穩定,且黏彈特性優于其它處理組。

2.6 表面疏水性

疏水作用對維持蛋白結構的穩定及蛋白凝膠的形成具有重要作用[36],利用ANS探針的熒光特性,可以測定疏水基團的暴露程度,從而研究蛋白三級結構的變化[37]。從圖6中可以看出,經高壓處理后的蛋白的表面疏水性顯著升高(p<0.05),且隨著壓力水平的增大而增大。這與文獻報道[11,30]相一致,可能是因為高壓處理促進了蛋白結構的解折疊,導致包埋的疏水基團暴露,或是蛋白結構的打開使ANS探針得以與蛋白的疏水內核相結合[38]。氯化鈉的加入同樣會對蛋白的原始構象產生影響,同一壓力水平下氯化鈉濃度越高,蛋白的構象變化越劇烈,表面疏水性也越高(p<0.05)。

圖6 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后在加熱過程中表面疏水性的變化Fig.6 Changes in surface hydrophobicity of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating

隨著溫度的升高,各處理組蛋白的疏水作用在40 ℃前均有輕微的上升,可能是因為在低溫狀態下大多數的疏水基團還包埋在蛋白的內部[39],故上升幅度不大。而在40～55 ℃的升溫區間內則呈現大幅增長,說明此時蛋白表面有大量的疏水基團被暴露,促進其進一步聚集與交聯[40],其中以200-1%處理組的蛋白的熒光強度的上升速率最高(37.5 a.u./℃)而100-1%處理組的其次(31.1 a.u./℃),Xue的研究[6]顯示在40～55 ℃間較高的疏水基團暴露速率可能是獲得保水性較高的凝膠的關鍵,這可能是因為當蛋白的變性速率高于其聚集速率時,蛋白分子結構得以充分解折疊與相互作用,從而形成均一有序的凝膠結構[41]。300-2%處理組的疏水作用在整個升溫過程中均顯著高于其他處理組(p<0.05),但疏水基團的過度暴露可能反而會使凝膠過程中的作用力失衡,不利于水分子與蛋白的結合,從而導致保水性的下降[17]。

2.7 活性巰基含量

作為肌球蛋白中的強還原性基團之一,巰基能夠維持蛋白三級結構的穩定,且對蛋白的功能特性具有重要影響[42]。圖7的結果顯示,壓力水平及氯化鈉濃度的升高均使經高壓處理后的蛋白中活性巰基的含量增大(p<0.05)。這與疏水作用的變化相似,說明高壓處理可以通過改變蛋白的分子構象使頭部包埋的巰基基團暴露并活化[15],而離子強度的升高會加速這一構象變化。在加熱過程中,除300 MPa各處理組外,其余處理組的活性巰基含量在40～55 ℃時均大幅上升,其中100-1%處理組的變化速率最快(21.76 μmol·100 mg-1/℃),說明此時蛋白的解折疊程度較高,其空間結構變化劇烈,大量的巰基基團被暴露,而疏水作用的同時增強會縮短分子間巰基的距離,加速二硫鍵的形成[43],從而促進蛋白的聚集。有研究顯示蛋白在加熱過程中包埋基團的快速暴露有助于對水分子的吸引和成膠階段的包裹[6],這也與其較高的保水相一致。300 MPa各處理組的活性巰基含量變化幅度較小,這可能是因為加熱前蛋白已形成一定程度的聚集,阻礙了基團的進一步暴露[28]。蛋白的熱變性程度與聚集能力也因此下降了。

圖7 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后在加熱過程中活性巰基含量的變化Fig.7 Changes in reactive sulfhydryl groups content of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating

70 ℃后,含1% NaCl的各處理組蛋白的活性巰基含量均呈現下降趨勢,說明此時已不再發生巰基的暴露參與作用,而已暴露的活性巰基也逐漸轉化為二硫鍵參與凝膠網絡的形成[39],而其他處理組蛋白的活性巰基含量則基本保持不變甚至略有上升。故推斷隨著氯化鈉濃度的升高,最終形成的蛋白凝膠中二硫鍵參與的比例有所降低,蛋白的交聯程度下降,這也部分解釋了含1% NaCl處理組蛋白的形成凝膠的流變特性優于同一壓力水平下其他處理組的原因。

2.8 二級結構

蛋白質二級結構的變化常會引起其功能特性的改變[44],利用圓二色譜技術可以較為準確的估算這種變化。圖8是不同氯化鈉濃度條件下的高壓處理蛋白在加熱過程中二級結構的變化。可以看出,在加熱前(25 ℃),經高壓處理后的肌球蛋白中α-螺旋結構的比例顯著低于對照組,且隨著壓力水平的升高而不斷降低,而β-折疊的比例則不斷升高。氫鍵和靜電作用是維持蛋白二級結構穩定的主要作用力[45],這種變化可能是由于高壓處理使得分子內氫鍵減弱而分子間氫鍵增強所引起[21,43]。而在同一壓力水平下隨著氯化鈉濃度的升高,α-螺旋結構的初始比例也不斷增大,也許是離子強度變化引起的分子間靜電作用改變所致。

圖8 氯化鈉含量不同的肌球蛋白在不同壓力水平下經處理后在加熱過程中二級結構比例的變化Fig.8 Changes in secondary structures proportion of myosin with various sodium chloride contents after pressurized under different levels during heating注：a:Control;b:100-1%;c:100-1.5%;d:100-2%;e:200-1%;f:200-1.5%;g:200-2%;h:300-1%;i:300-1.5%;j:300-2%。

有研究顯示,加熱前蛋白中α-螺旋結構的比例越高,加熱后β-折疊結構的比例越高,則形成的凝膠的保水性也越好[46-47],其中的原因包括蛋白質分子折疊時與呈α-螺旋狀相比擁有更多容納水分的空隙[32]。但在本研究中100和200 MPa各處理組的蛋白在加熱前α-螺旋的比例均低于對照組,最終形成的凝膠的保水性卻有提高,這主要是因為經高壓處理后的蛋白結構被打開,蛋白分子間距離增加,使更多的水分子可以穿透進入并保留在凝膠的網孔中,凝膠的保水性也得到提升[25]。

隨著溫度的升高,各處理組蛋白中的α-螺旋結構的比例開始減少而β-折疊及無規則卷曲的比例隨之增加。在40～55 ℃的升溫區間內,100-1%處理組蛋白的α-螺旋比例下降速度最快而200-1%處理組其次,說明此時蛋白尾部的解折疊程度較高,包埋基團的暴露速度也較快,這與疏水作用和活性巰基的變化情況相符,疏水作用的增強和二硫鍵的形成也有利于蛋白的進一步聚集與交聯。而經同等壓力水平處理的含1.5%或2%氯化鈉的蛋白雖然呈現相似的構象變化趨勢,但幅度減小,說明在加熱過程中蛋白解折疊的程度減弱了,這種變性方式和速率上的不同最終導致了形成的蛋白凝膠功能特性上的變化[6,45]。300 MPa各處理組的蛋白的二級結構在升溫過程中的變化幅度較小,最終α-螺旋結構的比例也較高。說明蛋白尾部的解折疊能力被抑制了。Wang等[30]認為經高壓處理的蛋白分子間的氫鍵隨著壓力水平(大于200 MPa)的升高不斷變弱,使蛋白與水間相互作用減小,故最終形成凝膠網絡結構較弱,保水性也較差。

3 結論

含1%氯化鈉的兔肉肌球蛋白經100或200 MPa的高壓處理(9 min,25 ℃)后,在升溫過程中充分解折疊,包埋的疏水基團和巰基快速暴露,促進了蛋白的聚集與交聯。最終形成具有均勻網絡結構,保水性好的凝膠。而氯化鈉濃度的增大會改變蛋白的熱變性速率,降低其解折疊程度;壓力水平的升高則會使蛋白在加熱前過度變性,這些均不利于其形成良好的熱凝膠。因此,1%的氯化鈉濃度是經200 MPa及以下高壓處理的兔肉肌球蛋白形成良好凝膠的最適濃度。該研究結果可為利用超高壓技術生產低鈉鹽肉制品提供參考。

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