高濃度培養乳酸菌發酵培養基的優化

吳軍林,柏建玲,莫樹平,張菊梅

(1.廣東環凱微生物科技有限公司,廣東廣州 510643;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)

乳酸菌(Lactic acid bacteria LAB)是指一群利用可發酵性碳水化合物,產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱[1]。乳酸菌是一類對人體有益的微生物菌群,廣泛分布在自然界。乳酸菌發酵能產生大量的有機酸、醇類及各種氨基酸等代謝物,具有抑制腐敗菌、提高消化率、防癌等生理功效[2]。高密度培養沒有確切的定義,是一個相對概念,指應用一定的培養技術和裝置提高菌體的發酵密度,使菌體密度較普通培養有顯著的提高,最終提高特定產物的比生產率[3]。這種培養優勢在于縮短生產周期、減少設備投資從而降低生產成本,能極大提高產品市場競爭力[4]。

乳酸菌要通過高密度培養技術達到理想的高濃度產量,需要優化一系列相關的工藝參數來對發酵過程進行嚴格的控制[5]。通過解決這些問題,設計出合適的培養途徑達到理想的菌體濃度。研究報道表明,影響乳酸菌增殖的因素有很多,如菌種的活力、培養代數、培養周期、培養液的初始pH、培養溫度、培養時間、接種量、增殖因子等,其中培養基的物理性質及成分會嚴重影響到乳酸菌菌體的收集工作,所以培養基的選擇多選用粘度小、蛋白質含量低的透明液[6]。另外培養基選擇合適的營養物質和適當濃度的營養物質是達到菌體高密度的重要途徑之一[7]。

本文根據乳桿菌R8菌的特性,篩選了最優的碳源和氮源,對培養基碳氮量及碳氮比、微量元素、緩沖體系、組分構成比例進行了優化,確定適宜R8菌高密度培養的發酵培養基。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳桿菌R8 由廣東省微生物研究所檢測新技術組篩選馴化提供[8]；MRS培養基、改良MRS培養基 廣東環凱微生物科技有限公司。

SIGMA 3K15臺式冷凍離心機 德國SIGMA公司;LRH-250生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;UV-1800全波長掃描分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

1.2.1.1 培養基制備 MRS培養基(g/L)：葡萄糖20.0 g,胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏8.0 g,酵母粉4.0 g,Tween80 1.0 mL,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,檸檬酸銨2.0 g,CH3COONa·3H2O 5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH6.2。

液體種子及發酵培養基—改良MRS培養基(g/L)：葡萄糖20.0 g,酵母粉30.0 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,KH2PO42.5 g,檸檬酸三銨2.5 g,CH3COONa·3H2O 6.25 g,Tween80 1.0 mL,pH6.2。平板計數用培養基：改良MRS液體培養基加1.5%～2%瓊脂。

1.2.1.2 菌種保存 乳桿菌R8菌株于甘油管中-20 ℃保存。

1.2.1.3 液體種子培養 取凍存的R8菌株,按2%的接種量接種于改良MRS培養基(100 mL培養基/250 mL三角瓶),37 ℃培養16 h。

1.2.1.4 液體發酵培養 將種子液按2%接種量接種于改良MRS培養基(50 mL培養基/250 mL三角瓶),37 ℃培養20 h[8-9]。

1.2.2 培養基碳源及氮源的篩選 在MRS培養基的基礎上，不改變氮源等其它成分，分別采用不同的碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、低聚麥芽糖、可溶性淀粉)和在MRS培養基的基礎上，不改變碳源等其它成分，分別采用不同的氮源(胰蛋白胨、酵母粉、麥芽提取物、大豆蛋白胨、牛肉膏、(NH4)SO4、KNO3)配制培養基，接種發酵，測定菌液OD600值，確定最佳的碳源及氮源。

1.2.3 培養基碳氮量及碳氮比的優化 在確定了最佳碳源及氮源后,在MRS培養基基礎上,選擇0.5∶1、1.0∶1、2.0∶1、3.0∶1的碳氮比配置培養基[10],接種發酵,測定菌液OD600值,確定適宜的碳氮量及碳氮比。

1.2.4 培養基微量元素的優化 以優化的碳氮源的培養基為基礎,分別添加不同量的不同微量元素(MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·4H2O 0.075 g/L，FeSO4·7H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl20.1 g/L)[10],以不添加微量元素作參照,接種發酵,測定菌液OD600值,確定微量元素的種類及用量。

1.2.5 培養基緩沖體系的優化 以優化了碳氮源及微量元素的培養基為基礎,不同種類的緩沖體系(Na2HPO4/NaH2PO4、K2HPO4/KH2PO4、Na2HPO4/KH2PO4、檸檬酸/檸檬酸鈉、Na2HPO4/檸檬酸、檸檬酸銨/乙酸鈉/KH2PO4)分別以不同濃度(0.00、0.02、0.04、0.08、0.10mol/L)添加,以不添加緩沖體系的培養基為對照,接種發酵,測定菌液OD600值,確定最優的緩沖體系。

1.2.6 培養基組分構成比例優化 通過培養基單因素實驗確定了適合R8菌生長的碳氮源、微量元素及緩沖體系,設計三因素兩水平考慮交互作用的正交實驗,以菌液的OD600值作為響應值,碳源含量(X1)、氮源含量(X2)、緩沖鹽含量(X3)為自變量,實驗因素及水平設計見表1。

表1 三因素二水平設計表Table 1 Three factors and two levels used in orthogonal test design

1.2.7 檢測方法

1.2.7.1 發酵液菌體干重測定 取一定體積的發酵液,8000 r/min離心10 min后用無菌水洗滌兩次,再將菌體60 ℃干燥后稱重,即可算得菌體干重,以g/L表示。

1.2.7.2 發酵液濃度測定 取一定體積培養液8000 r/min離心10 min,棄上清液,用等體積的無菌生理鹽水洗滌兩次后將菌體懸浮,測定600 nm下的吸光度值。

1.2.7.3 菌液活菌數測定 菌液用梯度稀釋法稀釋到一定倍數后涂平板,37 ℃培養48 h計數,結果以cfu/mL表示[9]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 培養基碳源優化

碳源是培養基主要成分之一,主要功能有兩方面:一是提供微生物菌體生長繁殖所需的能源及合成菌體所需的碳骨架;二是為菌體合成目的產物提供原料。常用碳源有糖類、油脂、有機酸和低碳醇等[11]。一般葡萄糖適合乳桿菌的生長。熊濤[12]、隋春光[13]等對植物乳桿菌高密度培養進行研究,優化碳源,發現葡萄糖是最佳碳源。本實驗主要以不同的糖類作為碳源進行培養,結果如表2所示。

表2 在不同碳源培養基中R8菌的 菌體密度Table 2 Absorbances of Lactobacillus R8 grown

表2顯示,不同的碳源對于R8的生長影響顯著(p<0.01),其中葡萄糖和乳糖的菌液OD600值最高,表明R8菌對葡萄糖和乳糖的利用能力最強,其次為果糖；蔗糖、可溶性淀粉利用能力較弱。故采用單因素實驗篩選出的碳源物質為葡萄糖和乳糖,但二者之間無顯著性差異。因考慮成本(乳糖是葡萄糖價格的兩倍以上),選擇葡萄糖作為最佳碳源。

2.2 培養基氮源優化

氮源主要用于構成菌體細胞和合成含氮代謝產物,主要包括有機氮源與無機氮源兩大類[14]。本實驗選擇了5種有機氮源和2種無機氮源進行培養,結果如表3。

表3 在不同氮源培養基中R8菌的 菌體密度Table 3 Absorbances of Lactobacillus R8 grown with different carbon and nitrogen

表3顯示,不同氮源對R8生長的影響差異顯著(p<0.01),整體看有機氮源要優于無機氮源,這主要因為乳酸菌自身酶系簡單,許多氨基酸不能自身合成,需從外界攝取,有機氮源除了提供氮外,還含有豐富的氨基酸及維生素,更利于菌體的生長[15]。從表3可得酵母粉的效果最好,大豆蛋白胨次之,其它幾種氮源效果相對較差,有許多對乳酸菌的研究都表明酵母粉是最適宜的氮源,如洪梅[16]、姚國強[10]等對不同乳桿菌培養條件進行優化,發現最佳氮源都為酵母粉,因此選擇酵母粉作為最佳氮源。

2.3 培養基碳氮比優化

培養基中的碳氮比例對微生物生長及產物合成的影響極為顯著[11]。氮源過量使菌體生長過于旺盛,易引起菌體的衰老和自溶;碳源過量則易形成較低的pH,不利于菌體生長[17]。不同碳氮量及碳氮比對菌體生長的影響結果見圖1。由圖1可看出培養基碳氮比例的不同對R8菌生長影響顯著(p<0.01),從碳氮比例看,在0.5～1之間時,菌體生長相對較好,當碳氮比大于1時,菌體濃度明顯下降。從碳氮總量看,菌體濃度隨著碳氮總量的提高而升高,但總量為40 g/L和50 g/L時,菌體濃度無顯著變化(p>0.01)。

圖1 不同碳氮量及碳氮質量比對R8生長的影響Fig.1 Effects of total concentration of nitrogen and carbon and carbon/nitrogen ratio on the absorbance of Lactobacillus R8注：相同字母的數據之間差異不顯著(p>0.01)，不同字母的數據之間差異顯著(p<0.01)。

2.4 培養基微量元素的優化

Fe,Mg,Mn,Zn,Ca等微量元素作為酶的激活劑或生物活性物質的組成成分也是微生物在生長過程中不可缺少的。這些物質一般在低濃度時對微生物生長和產物的合成有促進作用,高濃度時則表現出明顯的抑制作用[11]。圖2顯示了分別在培養基中添加不同濃度的MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O,FeSO4·7H2O,ZnSO4·7H2O,CaCl2時R8的生長情況。

圖2 Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+ 對R8生長促進作用比較Fig.2 Effects of different types of trace elements

由圖3可以看出與不添加微量元素相比,適量的添加一些微量元素有利于菌體的生長,當添加超過一定量時對菌體生長的促進作用會降低,而過量添加Zn2+會對菌體的生長產生明顯的抑制作用。由圖3可看出Mn2+對菌體生長的促進作用最為明顯,MnSO4·4H2O的最適添加量為0.075 g/L,菌濃比對照組提高20.7%。Mn2+作為乳酸脫氫酶的組成成分,是促進乳酸菌生長的關鍵因子之一,已有報道利用L.casei發酵乳清水解物生產乳酸時需補充Mn2+以提高乳糖的利用率及乳酸產率[18]。其次是Mg2+,當MgSO4·7H2O的最適添加量為2 g/L,菌濃比對照組提高15.5%。考慮到糖酵解的大部分過程中都必須有Mg2+作為輔助因子,所以選擇添加Mn2+和Mg2+。

圖3 不同濃度的Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+對R8生長的影響Fig.3 Effects of different concentrations of trace elements(Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+)on absorbance of Lactobacillus R8

2.5 培養基緩沖體系的優化

在培養基中添加緩沖鹽,一方面可調節細胞的滲透壓,另一方面主要是對發酵代謝產酸的細菌而言,添加緩沖鹽可以緩解乳酸造成的低pH對菌體的抑制作用。常用的緩沖體系有檸檬酸鹽、磷酸鹽和乙酸鹽等。不同緩沖體系對R8菌生長影響結果見表4。

由表4可看出具有緩沖體系的培養基中的菌體濃度明顯要高于對照組,不同緩沖體系之間以及同一緩沖體系不同濃度之間的差異顯著(p<0.01),其中檸檬酸銨/乙酸鈉/KH2PO4緩沖體系最適于R8菌的生長。

表4 在不同緩沖體系培養基中R8菌的菌體密度Table 4 Absorbance of Lactobacillus R8 in different buffered salt

2.6 正交實驗法優化培養基組分構成比例

本研究采用三因素二水平的考慮交互作用的正交實驗設計對培養基中主要成分(碳源、氮源、緩沖體系)的含量進行優化,以菌液濃度(OD600 nm)為響應值確定出最適培養基配方,實驗方案設計及結果見表5。

表5 考慮交互作用的正交實驗設計及結果表Table 5 The orthogonal test design and results table considering interaction

對表5中的實驗結果進行直觀分析,從不同因素所對應的極差值可看出因素X2(酵母粉)對菌體濃度的影響最大,其次是因素X1(葡萄糖),再次是X3(緩沖鹽),三個因素間的交互作用對菌體濃度的影響不明顯。從表5中可得出優化后的組合為X1(葡萄糖)20 g/L,X2(酵母粉)30 g/L,X3(緩沖鹽)1.0 mol/L。

對實驗結果進行方差分析,分析結果見表6。

表6 方差分析表Table 6 The variance analysis table

在表6中,X1X2,X1X3,X2X3的離差相對很小,說明這三項的作用不顯著(p>0.01),將這三項并入誤差項,并取誤差項的自由度為4相自由度之和,進而算得均方離差及F值。由方差分析的結果可知葡萄糖,酵母粉和緩沖鹽對菌體的生長具有顯著影響(p<0.01),而三種營養成分之間的交互作用對菌體生長并無顯著影響(p>0.01)。經過以上系統的篩選和優化,確定適宜的發酵培養基配方(g/L)為:葡萄糖20.0 g,酵母粉30.0 g,MnSO4·4H2O 0.075 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,KH2PO42.5 g,檸檬酸銨2.5 g,CH3COONa·3H2O 6.25 g,Tween80 1.0 mL,pH6.2。菌體濃度(OD600 nm)達到2.38。

3 結論

針對前期篩選出的耐胃液耐膽汁菌株R8的營養需求,對其發酵培養基的成分及含量進行系統的篩選和優化,確定適宜的發酵培養基配方(g/L):葡萄糖20.0 g,酵母粉30.0 g,MnSO4·4H2O 0.075 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,KH2PO42.5 g,檸檬酸銨2.5 g,CH3COONa·3H2O 6.25 g,Tween80 1.0 mL,pH6.2。菌體濃度(OD600 nm)達到2.38。

乳酸菌在生長過程中會產生大量的乳酸,使pH下降到菌體耐酸的極限,此時即使有充足的營養,菌體細胞的進一步生長也會受到抑制[19-21]。因此僅提供足夠的營養物質還不夠,必須通過補充營養物質、排出代謝產物、調節pH等措施,盡量減少和降低代謝產物對菌體生長的抑制[22-25]。因此接下來需要對R8菌株的培養條件、培養方式等進行深入研究,為該菌的后續工業化生產奠定基礎。

[1]楊潔彬,郭興華,張篪,等.乳酸菌-生物學基礎應用[M].北京:中國輕工業出版社,1996:1-10.

[2]唐京,陳明,柯文燦,等.乳酸菌在疾病防治和人體保健中的應用研究進展[J].微生物學雜志,2017,37(4):98-108.

[3]劉子宇,李平蘭,鄭海濤,等.微生物高密度培養的研究進展[J].中國乳業,2005(12):47-51.

[4]史媛英,肖冬光.酸奶發酵劑高濃度培養的研究[J].天津輕工業學院學報,1999(1):20-25.

[5]Riesenberg D,Guthke R. High-cell-density cultivation of microorganisms[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1999,51(4):422-430.

[6]Tripathi P,Beaussart A,Andre G. Towards a nanoscale view of lactic acid bacteria[J].Food Chemistry,2012,43(12):1323-1330.

[7]陳堅.發酵工程實驗技術[M].北京:化學工業出版社,2003:68-82.

[8]柏建玲,吳清平,張菊梅,等.耐胃液乳酸菌的篩選、鑒定與馴化[J].食品工業科技,2010,31(11):190-192,195.

[9]柏建玲,莫樹平,鄭婉玲,等.乳酸菌增菌培養基的營養因子優化[J].食品與發酵工業,2007,33(2):79-81.

[10]姚國強,張雪梅,高志敏,等.Lactobacillus ruuteri IMAU10240增殖培養基及高密度培養工藝優化[J].食品科學,2017,38(14):97-105.

[11]韓德權編.微生物發酵工藝學原理[M].北京:化學工業出版社,2013:68-100.

[12]熊濤,黃錦卿,宋蘇華,等.植物乳桿菌發酵培養基的優化及高密度培養技術[J].食品科學,2011,32(7):262-268.

[13]隋春光,梁金鐘,王風青.植物乳桿菌LP-S2高密度培養的研究[J].糧食與飼料工業,2016,12(8):49-53.

[14]馮慧杰,沐萬孟,張濤,等.乳酸乳球菌的高密度發酵研究[J].食品工業科技,2014,35(14):197-201.

[15]俞俊棠,唐孝宣.生物工藝學[M].上海：華東理工大學出版社,1999:101-102.

[16]洪梅,刁其玉,閆貴龍,等.一株發酵乳桿菌培養條件的優化[J].飼料工業,2010,31(19):26-29.

[17]黃宇,孫寶盛,孫井梅,等.枯草芽孢桿菌發酵條件的研究[J].中國乳品工業,2007(3):180-183.

[18]高艷玲,郭明若.利用L.casei及L.lactis發酵乳清滲透液生產高純度L-乳酸[J].中國乳品工業,2008,36(3):4-9.

[19]Thunell R K. Frozen starters from internal-Ph-contronal-grown-cultures[J].J of dairy sci，1984,67(1):24-36.

[20]史媛英,肖冬光.酸奶發酵劑高濃度培養的研究[J].天津輕工業學院學報,1999(1):20-25.

[21]Ballongue J,Salminen S,Wright A,et al. Lactic acid bacteria microbiological and functional aspects[M].New York:Marcel Dekker Inc,2004:67-124.

[22]Janer C,Pelaez C,Requena T. Caseinomacropeptide and whyprotein concentrate enhance bifidobacterium lactis growth in milk[J].Food Chemistry,2004,86(2):263-267.

[23]Gonzalez R,Blancas A,Santillana R,et al. Growth and final product formation by bifidobacterium infantis in aerated fermentations[J].Applied and Environment Microbiology,2004,65(5):606-610.

[24]李旭華.乳酸細菌濃集條件的研究[D].西安:陜西科技大學,2010.

[25]韋海陽,孫文敬,崔鳳杰,等.微生物高細胞密度培養技術及其在食品添加劑生產中的應用[J].中國食品添加劑開發應用,2013(2):204-213.