金槍魚蒸煮液酶解工藝優化 及風味海鮮調味汁的制備

陳啟航,朱秀花,俞 珺,余 娟,方旭波,*,陳小娥,,江旭華

(1.浙江海洋大學東海科學技術學院,浙江舟山 316000;2.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022;3.浙江富丹旅游食品有限公司,浙江舟山 316104)

金槍魚,又叫鮪魚、吞拿魚,具有低脂肪、營養豐富等優點[1-2]。金槍魚在加工成魚柳及金槍魚罐頭時,會產生大量蒸煮液,其蒸煮液仍含有大量蛋白質、核苷酸、氨基酸等多種營養成分和風味物質,是生產調味品、蛋白營養強化劑等食品的優質原料。而目前我國的金槍魚蒸煮液沒有得到良好的開發利用,大都未經處理直接排放,不僅極大地浪費蛋白質資源,而且污染環境。采用酶解技術酶解蒸煮液中的蛋白質,反應條件溫和,不破壞或很少破壞原有營養物質,并且工藝簡單,設備要求不高[3]。

目前,國內對蒸煮液的研究多集中在其他海產品上,趙華杰等[4]利用貽貝蒸煮液加工得到呈味良好、風味獨特的發酵調味品;張露等[5]以鯖魚罐頭蒸煮液為原料,采用酶解工藝制備具有抗氧化功能的生物活性肽;鄭曉杰等[6]利用毛蝦蒸煮液加工成毛蝦粉水產調味料,并對其噴霧干燥工藝進行了優化;而關于金槍魚蒸煮液加工利用的研究報道基本處于空白階段。因此,如果以金槍魚蒸煮液為原料開發成消費者喜愛的、具有海鮮風味的調味汁,既能夠增加原料附加值,同時又可解決廢水排放帶來的環境污染等問題。

本實驗以金槍魚蒸煮液為主要原料,以水解度[7-8]為指標,篩選出最合適的蛋白酶,在此基礎上,考察酶解時間、pH、溫度和加酶量對水解度的影響,結合響應面分析[9-10]研究酶解最佳工藝條件,并對其脫腥和殺菌工藝進行優化[11-12],同時以白糖、食用鹽、蠟質玉米變性淀粉為配料,制成風味獨特的金槍魚蒸煮液調味汁,以便更合理地開發利用蒸煮液,同時滿足市場對天然海鮮調味品的需求[13-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰹魚蒸煮液 經測定其蛋白質含量為3.71%,-20 ℃冰箱保存,取自浙江富丹旅游食品有限公司;食用鹽、白糖、醬油 市售;蠟質玉米變性淀粉 東莞東美食品公司;安琪高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;木瓜蛋白酶(1×105U/g)、中性蛋白酶(1×105U/g)、堿性蛋白酶(1×105U/g)、胰蛋白酶(4×103U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;胃蛋白酶(2.1×104U/g) 美國Sigma公司;其他試劑 均為分析純。

HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海棱光技術有限公司;TGL-16C低速大容量離心機 軍事醫學科學院實驗儀器廠;Kjeltec400自動定氮儀 丹麥FOSS公司;RE-52CS-1旋轉蒸發 上海亞榮生化儀器廠;BS110S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;PHS-3B精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;YXQ-LS-50G壓力蒸汽滅菌器 上海科曉科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 風味調味汁工藝流程 金槍魚蒸煮液→酶解→滅酶→離心→脫腥→濃縮→調配→滅菌→調味汁成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 酶解處理 將蒸煮液調節到最適pH,置于一定溫度水浴鍋中,待其溫度讀數穩定后添加一定量的酶,酶解一定時間后,并置于沸水中滅酶處理10 min,使蛋白酶鈍化,之后取出冷卻至室溫。

1.2.2.2 離心 滅酶后經4000 r/min離心10 min,除去不溶物和懸浮物,去除上層油脂,取上清液即可得到金槍魚酶解液。

1.2.2.3 脫腥 采用酵母發酵法[18-19],在300 mL酶解液中分別添加0.25%～0.75%的酵母進行發酵脫腥處理,在30～40 ℃條件下發酵50～70 min,以除去魚腥味。

1.2.2.4 濃縮 采用真空濃縮方法對金槍魚酶解液進行濃縮處理,將金槍魚酶解液裝入到旋轉蒸發器中,濃縮溫度調為55 ℃,濃縮至原先體積的三分之一左右。

1.2.2.5 調配 經過濃縮后可得到黃色液體,為進一步提高鮮味,以酶解液為基料,按照以下配方進行調配:白糖2%、食用鹽6%、蠟質玉米變性淀粉1.5%,攪拌使其混勻。

1.2.2.6 滅菌 置于200 mL玻璃瓶中,密封,90 ℃下滅菌30 min或 121 ℃下滅菌20 min,冷卻,即金槍魚風味海鮮調味汁。

1.2.3 最適蛋白酶的選擇 取100 mL蒸煮液,分別添加200 U/g的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶,酶解2 h,其中胃蛋白酶酶解液pH2.5、溫度45 ℃,其余在自然pH、55 ℃溫度條件下進行酶解,以水解度為指標,比較各蛋白酶對蒸煮液的酶解效果的差異。

1.2.4 金槍魚蒸煮液酶解單因素實驗 蛋白酶添加量(100、200、300、400、500 U/g)、酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解時間(2、3、4、5、6 h)、pH(6、6.5、7、7.5、8)作為單因素進行實驗,研究單因素對水解度的影響,其余各因素的固定水平為加酶量300 U/g、溫度為55 ℃、酶解時間為3 h、pH為7。每組重復實驗3次,來確定酶解最佳工藝。

1.2.5 響應面優化酶解金槍魚蒸煮液實驗 在單因素實驗基礎上,以水解度為響應值,采用響應面對酶添加量、酶解溫度、酶解時間這三個因素進行優化,響應面實驗因素與水平設計編碼見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 酶解液脫腥工藝正交實驗設計 為了優化酵母發酵脫腥的工藝條件,本實驗選用安琪高活性干酵母,在考察單因素(發酵時間、發酵溫度、酵母添加量)對腥味值影響的基礎上,對其進行L9(34)正交實驗。正交實驗設計及水平編碼見表2。

1.2.7 酶解液殺菌條件確定 將產品分別采用121 ℃/20 min高溫高壓殺菌、90 ℃/30 min巴氏殺菌兩種殺菌方式殺菌后,置于室溫陰涼處依次保存15、30、60 d后,以感官評價、大腸菌群和菌落總數為指標,考察這兩種殺菌方式對產品殺菌效果的影響,以此確定酶解液較佳的殺菌條件[3]。

1.3 實驗指標測定

1.3.1 蛋白質含量 參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》[20]測定。

1.3.2 水解度的測定 甲醛滴定法測定,甲醛滴定法可以用來測定氨基氮,對于氨基氮含量以消耗的NaOH量為指標。計算公式為:

1.3.3 腥味值測定 由10名對魚腥味比較敏感并經過專門訓練的食品科學與工程專業學生組成評判小組,將品嘗后感受到的腥味以分數表示。0無腥味;1略有腥味;2腥味較弱;3有腥味;4腥味一般;5腥味偏重;6腥味較重;7腥味很重。分為7個級別進行評分,滿分共7分,其中分值越低,則表示魚腥味越輕。

1.3.4 感官評定指標 以金槍魚蒸煮液濃縮汁作為基料,選擇經過培訓且身體健康,味覺、視覺正常的具有感官評價知識的食品科學與工程專業學生10人,以滋味、色澤、氣味、形態為評價指標,確定最佳調配方式,先看再聞后嘗,對制備的調味汁進行感官評定,滿分40分,滋味、色澤、氣味、形態各10分,分值越大,說明調味汁風味越好,最終結果剔除異常數,求取平均值,打分標準如表3。

表3 風味海鮮調味汁感官評價表Table 3 The sensory evaluation table of flavor seafood sauce

1.3.5 氨基酸態氮含量 參照GB 5009.39-2016《醬油衛生標準的分析方法》[21]測定。

1.3.6 可溶性固形物、鹽分測定 參照王曉賓等[22]測定。

1.3.7 微生物指標 參照GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗:菌落總數測定》[23]和GB 4789.3-2016《食品微生物學檢驗:大腸菌群計數》[24]測定、GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗:沙門氏菌檢驗》[25]、GB 4789.5-2016《食品微生物學檢驗:志賀氏菌檢驗》[26]、GB 4789.10-2016《食品微生物學檢驗:金黃色葡萄球菌檢驗》[27]。

1.4 數據處理

采用Origin Pro 8.5軟件繪圖,響應面實驗通過Design Expert8.0.6進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶酶解工藝優化

2.1.1 不同蛋白酶對金槍魚蒸煮液酶解效果的篩選 酶具有高效、專一性,在很大程度上會影響產品的質量和風味,所以需要選擇最合適的酶來進行酶解。由圖1可見,木瓜蛋白酶的水解度最高,水解度達到17.16%,胰蛋白酶和中性蛋白酶較好,堿性蛋白酶次之,胃蛋白酶效果最差。就木瓜蛋白酶而言,該酶對動物蛋白的水解效果較好,且水解物苦味較弱[28],所以本實驗選用木瓜蛋白酶進行水解。

圖1 不同蛋白酶對金槍魚蒸煮液水解效果比較Fig.1 Comparison of hydrolysis effect of different proteases on Skipjack Tuna cooking liquor

2.1.2 金槍魚蒸煮液酶解的單因素實驗

2.1.2.1 蛋白酶添加量對蒸煮液酶解效果的影響 圖2表明,當酶用量在100～300 U/g時,水解度隨著酶用量的增加而呈現增大的趨勢,當酶用量達到300 U/g后,酶用量繼續增加,水解度增加逐漸減緩,是由于底物逐漸消耗,酶趨于飽和狀態。綜合經濟效益,加酶量為300 U/g比較適宜。

2.1.2.2 酶解溫度對蒸煮液酶解效果的影響 由圖3可見,隨著酶解溫度的升高,水解度增加,酶解溫度為55 ℃時,水解度達到最大值,其后逐漸下降。這是因為隨著溫度升高,蛋白酶活力也逐漸增加,酶促反應也加快,但當超過最適溫度,酶活力逐漸下降,反應速率也隨之降低。故本實驗酶解溫度為55 ℃左右較為適宜,與姚芳等[15]研究結果相似。

圖3 酶解溫度對金槍魚蒸煮液酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on enzymatic hydrolysis of Skipjack Tuna cooking liquor

2.1.2.3 酶解時間對蒸煮液酶解效果的影響 圖4表明,水解度隨著酶解時間的延長而增加,酶解時間在4 h以內,水解度逐漸增加。超過4 h,隨著時間的增加,水解度則增長緩慢,是由于隨著酶解時間的延長,可能會導致酶失活,酶活力下降,而且過度水解導致氨基酸的破壞,使蛋白質含量降低[29]。綜合經濟效益,酶解時間為4 h比較適宜,該結果與李陽等[30]研究結果相似。

圖4 酶解時間對金槍魚蒸煮液酶解效果的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on enzymatic hydrolysis of Skipjack Tuna cooking liquor

2.1.2.4 pH對蒸煮液酶解效果的影響 由圖5可見,pH對酶水解也會造成一定影響,在pH為7.0,水解度達到最大,為27.24%,是由于木瓜蛋白酶的最適合pH6.5～7.5,pH在此范圍內有利于酶解反應的進行。綜合考慮,本實驗pH最佳為7.0。

圖5 pH對金槍魚蒸煮液酶解效果的影響Fig.5 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of Skipjack Tuna cooking liquor

2.2 酶解金槍魚蒸煮液條件的響應面實驗

2.2.1 回歸模型的確定及響應面分析 響應面實驗結果見表4,通過軟件處理,除去不顯著項得到水解度模型的二次多項回歸方程為:

表4 響應面設計方案及結果Table 4 Design and results of response surface analysis

Y=27.05+1.17A+1.70B-0.53C+0.19AB+1.31AC-0.44BC-2.26A2-3.40B2-3.04C2

方差分析結果見表5,由表5可知,模型p<0.0001,而失擬項不顯著p=0.6772>0.05,表明模型顯著,二次模型選擇合適。因素A、B、AC以及A2、B2、C2對結果影響極顯著(p<0.01),因素C對結果影響顯著(p<0.05),AB對結果影響不顯著(p>0.05),該數學模型F值反映出該方程在實驗點與實驗結果相吻合。失擬性檢驗F值表明回歸方程擬合的較好,方程沒有失擬因素存在。同時,軟件分析中R2為0.9909,變異系數為2.03%,說明模型能夠反映真實情況。從因素分析可知,反應條件對水解度影響大小排序為酶解溫度>酶添加量>酶解時間,這與蘇偉等[31]研究結果相似。

表5 方差分析結果Table 5 Variance analysis result

2.2.2 響應曲面圖分析 圖6中酶解時間固定為4 h,可見酶解溫度軸上響應面值更陡峭,可見酶解溫度因素比酶添加量因素對水解度影響大;圖7中酶解溫度固定為55 ℃,酶添加量較酶解時間的響應面較陡峭,因此酶添加量較酶解時間對水解度的影響更大;圖8酶添加量固定為300 U/g,可見酶解溫度軸上響應面值較陡峭,所以酶解溫度因素比酶解時間因素對水解度影響大。從坡度上分析,圖7響應面坡度大于圖6和圖8,說明酶添加量和酶解時間對水解度影響較大。由此可見,得出的結論與方差分析結果一樣。

圖6 酶添加量與酶解溫度對水解影響的等高線與響應面Fig.6 Three-dimensional curved and contour plot for effect of enzyme dosage and enzymolysis temperature on degree of hydrolysis

圖7 酶添加量與酶解時間對水解度的影響的等高線和響應面Fig.7 Three-dimensional curved and contour plot for effect of enzyme dosage and enzymolysis time on degree of hydrolysis

圖8 酶解溫度與酶解時間對水解度影響的等高線與響應面Fig.8 Three-dimensional curved and contour plot for effect of enzymolysis temperature and enzymolysis time on degree of hydrolysis

2.2.3 驗證實驗結果 通過Design-Expert 8.0.6得到二次多項回歸方程,針對水解度取得最大值進行條件優選,得出在實驗因素水平范圍內預測金槍魚酶解液最佳工藝條件為,酶添加量312.04 U/g,酶解溫度56.26 ℃,酶解時間3.96 h,水解度預測值為27.4335%。結合實驗的可行性,選取酶添加量300 U/g,酶解溫度56 ℃,酶解時間4 h,在最優條件下進行3次驗證實驗,實際測得的水解度為27.44%±0.04%,指標獲得了相應的提高且與理論值相差較小,因此模型設計合理。

2.3 酶解液脫腥發酵工藝

酵母發酵除腥是指通過酵母的新陳代謝作用,去除水產品的腥味和異味。酵母粉去腥速度快并且徹底;酵母發酵過程中產生的中間代謝產物對腥味有掩蔽作用;適用于液態魚制品條件下使用[32]。本實驗采用酵母發酵脫腥法,以腥味值為評價指標,對酵母發酵時間、發酵溫度、添加量這三個因素進行優化篩選。正交結果見表6。可以看出,脫腥效果為A>B>C,最佳脫腥的條件是發酵時間60 min,發酵溫度35 ℃,酵母添加量0.75%。由K值可以得出實驗的最佳組合為A2B2C3。在酶解液最佳脫腥工藝下進行正交驗證實驗,腥味值3次測定,分別為0.85、0.95、0.80,平均值為0.867,低于正交表中的任一數據,說明正交實驗得到的酵母脫腥工藝優化參數具有可靠性和適用性。

表6 酵母發酵脫腥正交實驗結果Table 6 Results of orthogonal experiment of deodorization by yeast fermentation

2.4 風味海鮮調味汁最佳殺菌條件確定

由表7可知,經過121 ℃/20 min高溫高壓殺菌條件的樣品,雖然殺菌時間較短,但溫度過高會影響其原有營養物質和風味[33],造成魚香味消失,也會使酶解液中的氨基酸、蛋白質等營養物質受到破壞,組織結構造成一定影響,口感下降。而90 ℃/30 min的巴氏殺菌條件使調味汁中產生了濃郁的魚香味,呈黃棕色、鮮亮有光澤,既達到商業無菌的目標,又極大的保留原有的風味和營養成分,在此條件下,調味汁口感細膩,有魚鮮味。殺菌后,置于常溫條件下保存,由表8可知,兩種殺菌條件均可達到延長保質期的目的,殺菌效果良好,未檢出菌落總數和大腸菌群。結合感官評價和殺菌效果指標,兩種條件相比較,最終選擇90 ℃/30 min的殺菌條件,與張井等[33]研究結果相似。

表7 達到殺菌目標的風味海鮮調味汁感官評價Table 7 Results of sensory evaluation of flavor seafood sauce with desired sterilization effect

表8 不同殺菌條件殺菌效果的比較Table 8 Comparison of sterilization condition effects

2.5 金槍魚風味海鮮調味汁質量指標

經檢驗該調味汁呈流體狀、黃棕色、味道鮮美,魚香味濃郁,致病菌未檢出,產品質量指標見表9。

表9 風味海鮮調味汁質量指標分析Table 9 Analysis of quality index on flavor seafood sauce

3 結論

本實驗以水解度為指標,通過響應面法得到金槍魚蒸煮液的最佳酶解方式為:在56 ℃、添加量為300 U/g條件下酶解4 h,此時水解度為27.44%±0.04%。利用正交實驗得到最佳脫腥參數組合為酵母0.75%、發酵溫度35 ℃、發酵60 min,在90 ℃條件下巴氏殺菌30 min,最終得到金槍魚風味海鮮調味汁口感較佳,有魚鮮味,風味宜人。本文為金槍魚蒸煮液的高值化利用提供了理論依據。

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