響應面法優化草莓酵素的 發酵工藝及其生物活性初探

崔國庭,王 緞,劉向麗,任國艷,郭金英,王 萍

(河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471023)

草莓是薔薇科草莓屬多年生草本植物,果實色澤鮮艷、酸甜可口、風味獨特,素有“水果皇后”的美譽[1]。草莓富含人體必需的營養物質,尤其是VC、VE和多酚類化合物等抗氧化物質[2-3],草莓所含的抗氧化物質能夠防護、清除和修護機體中產生的過量自由基,保護機體免受自由基的傷害[4],具有降低心血管慢性疾病和癌癥等的作用[5]。草莓不耐儲藏和運輸,成為了限制草莓產業發展的瓶頸。因此,草莓產品的開發及草莓的保鮮技術研究成為了草莓產業發展的關鍵所在。草莓產品目前主要有果醬[6]、果汁[7]、果酒[8]等。

酵素是以一種或幾種水果、蔬菜等為原料,經過微生物(酵母、乳酸菌)發酵產生的含有豐富維生素、酶、礦物質和次生代謝產物的功能性產品[9-11]。水果酵素具有抗氧化、平衡內分泌、活化細胞、美容養顏、提高身體免疫和增強身體抵抗力等功效[12-13]。草莓酵素是以草莓為原料,經益生菌發酵后獲得的含有多種維生素、礦物質和代謝產物等功能性發酵產品。將草莓制成草莓酵素,是草莓深加工過程中最有潛力的加工方式之一,不僅延長了草莓產品的貨架期,也提升了草莓的附加值。目前,國內外缺少有關草莓酵素研究與應用的報道。

本文以草莓為實驗原料,通過響應面法優化草莓酵素的發酵工藝,以確定草莓酵素的最佳發酵條件,同時測定草莓酵素中酶的活性,并以羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和還原力為考察指標,研究貯藏過程中草莓酵素體外抗氧化性能的變化規律,為草莓酵素的開利用和相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓和安琪酵母(生產日期2017.03.01) 丹尼斯超市;鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、EDTA、三氯化鐵、三氯乙酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、聚乙烯醇、3,5-二硝基水楊酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、Tris、氫氧化鈉、可溶性淀粉 分析純，天津德恩化學試劑有限公司。

725型紫外可見分光光度計 天津精密科學儀器有限公司;MIR-254恒溫培養箱、HH-S水浴鍋 上海精密科學儀器有限公司;FA2004B型電子天平 上海心儀儀器科技有限公司;EPPENDORF型移液槍、GTR21-1高速離心機 北京精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草莓酵素的制備 草莓洗凈、晾干,按草莓∶白砂糖=3∶1 (w/w)的比例將草莓和白砂糖放入含有0.3% VC+0.5% 檸檬酸的去離子水(水∶草莓=8∶1 w/w)中,護色、打漿,按比例接入酵母進行發酵,發酵結束后,發酵液過濾,獲得草莓酵素。將所獲得的草莓酵素離心,取上清液待測。

1.2.2 測定方法 取獲得的草莓酵素上清液,進行超氧化物歧化酶(SOD)活力測定,SOD活性的測定采用鄰苯三酚自氧化法[14],淀粉酶測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[15],脂肪酶測定采用滴定法[16]。

1.2.3 草莓酵素制備單因素實驗

1.2.3.1 酵母接種量 酵母接種量分別以0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%添加,在30 ℃條件下發酵15 h,發酵結束后采用鄰苯三酚的自氧化法測定SOD活性,重復三次,考察酵母菌接種量對SOD活性的影響,以確定酵母適宜接種量。

1.2.3.2 發酵時間 30 ℃條件下接種1%酵母菌,分別發酵6、9、12、15、18、21、24 h,發酵結束后測定SOD活性,重復三次,考察發酵時間對SOD活性的影響,確定適宜發酵時間。

1.2.3.3 發酵溫度 接種1%酵母菌,在20、25、30、35、40、45 ℃條件下發酵12 h,發酵結束后測定SOD活性,重復三次,考察發酵溫度對SOD活性的影響,確定適宜發酵溫度。

1.2.4 響應面實驗 根據單因素實驗結果,根據Box-Benhnken 實驗設計原理,以發酵溫度、發酵時間、酵母菌接種量為自變量進行組合優化,以SOD活性為響應值,進行響應面分析。實驗設計方案如表1所示,采用Design expert 8.0.6軟件進行數據處理和回歸分析,獲得酵素發酵的最佳工藝條件。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of the Box-Behnken experiment

1.2.5 草莓酵素的抗氧化活性實驗

1.2.5.1 對超氧陰離子自由基清除作用的測定 取4.5 mL 0.05 mL pH8.2的Tris-HCl于試管中,在25 ℃恒溫水浴鍋水浴20 min。然后在試管中加入0.1 mL樣品液和0.9 mL去離子水,然后加入0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚,混勻后在25 ℃恒溫水浴鍋水浴5 min,最后加入1 mL 8 mol/L HCl結束加樣。以Tris-HCl作參比溶液。調節紫外分光光度計在299 nm下測定吸光度[17]。實驗以1 mL試樣代替樣品液作空白對照。

1.2.5.2 對羥自由基清除作用的測定 取0.5 mL樣品于試管中,然后依次加入1.4 mL 6 mmol/L雙氧水、0.6 mL 20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵,混合充分后,在37 ℃恒溫水浴1 h。以去離子水作參比溶液。調節分光光度計在562 nm測定吸光度[18]。

“我剛從醫院請假來出庭。我想向法庭陳述三點事實和理由：一是我與海力先生的關系純屬正常的主雇關系，我有鐵證來證實；二是我對被告侵權的看法；三是我對訟訴目的的陳述。首先，我要向審判長逞上證明我與海力先生關系正常的鐵證。”

1.2.5.3 對 DPPH自由基清除作用的測定 參考文獻[19-20]的方法,并進行適當的修改。取2 mL樣品溶液,加入等體積的DPPH溶液(0.1 mmol/L),在微型旋渦混合儀上搖勻,在室溫條件下,避光放置30 min,在波長517 nm處測定吸光度值。DPPH的清除率按以下公式進行計算:

1.2.5.4 還原力測定 取0.5 mL樣品液于試管中,然后在試管中加入2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀,混勻后在50 ℃下反應30 min,然后加入2.5 mL 0.1 g/mL三氯乙酸,混勻后在離心機中以3000 r/min轉速下離心10 min。離心后取2.5 mL上清液,然后依次加入2.5 mL去離子水,0.5 mL 1 g/L三氯化鐵,混勻。以去離子水作參比溶液,調節分光光度計在700 nm下測定吸光度[21]。樣品吸光度值越大,表明還原力越強。

1.3 數據處理

實驗進行3 次重復操作,實驗數據處理、統計分析和圖表繪制采用Design-Expert 8.0.6和GraphPad.Prism 5.0軟件。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵單因素實驗

以SOD活性為評價指標,考察草莓酵素在發酵過程中,酵母菌接種量、發酵時間和發酵溫度對酵母發酵過程中產生的SOD活性的影響,結果見圖1。

圖1 接種量(A)、發酵時間(B) 和發酵溫度(C)對SOD活性的影響Fig.1 Effect of inoculation amount(A)，fermentation time(B) and fermentation temperature(C)on SOD activity

由圖1(A)可得,酵母接種量在0.1%～1.0%之間時,隨著接種量的增加,SOD活性呈上升趨勢,當接種量達到1.0%,SOD活性達到最高33.04 U/mL;當接種量在超過1.0%以后,隨著酵母接種量的增加,SOD活性呈下降趨勢。這可能是隨著酵母接種量的增加,在發酵的后期,由于糖被消耗完,菌體開始利用有機酸作為碳源,pH隨著有機酸的消耗而上升。pH的改變引起了SOD活性的下降。因此,選擇1.0%的接種量,SOD活力最高。

由圖1(B)可得,隨著發酵時間的延長,SOD活力上升,當發酵時間達到12 h,SOD活力達到頂峰,再延長發酵時間,SOD活力趨于平緩并略有降低。這可能是在發酵后期,糖被消耗殆盡,繼續延長發酵時間,菌體以有機酸為碳源進行發酵,造成了pH的改變,從而引起了SOD活性的變化。因此發酵時間控制在12 h,SOD活力最高。

由圖1(C)可得,在發酵溫度低于30 ℃時,隨著發酵溫度的升高,SOD活性也隨之增加,當發酵溫度為30 ℃,SOD活性達到33.27 U/mL。當發酵溫度進一步升高,SOD的活性呈下降趨勢,可能是發酵溫度過高,超出了酵母的最適發酵溫度,酵母發酵能力降低造成的影響,因此發酵溫度控制在30 ℃,SOD活力最高。

2.2 響應面法優化

2.2.1 Box-Behnken實驗結果及方差分析 在單因素實驗的基礎上,以酵母菌接種量(A)、發酵時間(B)和發酵溫度(C)三個因素為自變量,以SOD活性為響應值,優化草莓酵素的發酵工藝。結果見表2。利用Design Expert 8.0.6軟件,對表2的數據建立二次回歸模型,擬合的二次多元回歸方程如下:

表2 響應面實驗方案與結果Table 2 Response surface experiment scheme and results

Y=34.1+1.8A+1.2B+1.2C-0.15AB+0.85AC-0.55BC-0.25A2-0.555B2-0.705C2

由表3可得,模型p<0.0001,達到極顯著(p<0.01)水平,失擬項p=0.3207>0.05,不顯著,表明模型選擇合適,擬合度良好。R2=0.9911 表明該模型對實驗點的適配度達到 99.11%,具有較高的擬合度,實驗誤差較小,可以利用該模型預測上述發酵條件對酵素中SOD活力的影響。各因素的p值可以看出,回歸模型中的A、B、C、AC、BC、B2和C2影響極顯著(p<0.01),交互項AB及二次項A2影響均不顯著(p>0.05),表明各因素對SOD活性的影響不同,調整不同因素將達到不同的提取效果。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.2.2 響應曲面和等高線圖分析 響應面實驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,獲得了接種量、發酵時間、發酵溫度三個因素之間的交互作用影響。由圖2A可以看出,等高線圖呈橢圓形,表明接種量和發酵溫度交在實驗范圍內互作用顯著,圖2B顯示響應面顯示坡度較陡峭,表明SOD活性隨著接種量和發酵溫度變化響應敏感,這與方差分析結果一致。圖2D為接種量為1%時,發酵溫度和發酵時間對SOD活性的交互作用。當發酵溫度一定時,隨著發酵時間的延長,SOD活性先增大后趨于平緩;當發酵時間一定時,隨著發酵溫度的增加,SOD活性先增大后減小的趨勢。等高線密集,表明響應值(SOD活性)在實驗條件內存在極高值,交互作用顯著,與分析結果一致。

圖2 各因素交互作用對SOD活性影響的等高線與響應面圖Fig.2 Contour graph and response surface plot for the effect of various factors on the activity of SOD

2.3 驗證性實驗

從響應面實驗分析獲得最佳工藝條件:接種量為1.5%、發酵時間為13.35 h、發酵溫度為35 ℃,此條件下SOD活性預測值為37.21 U/mL。為了驗證模型預測的準確性,采用響應面優化后的工藝條件進行草莓酵素的制備,考慮到實際操作的便利,將發酵工藝條件修正為:接種量為1.5%、發酵時間為13.5 h、發酵溫度為35 ℃。發酵所得酵素的SOD活性為(35.98±1.53)U/mL,與預測值37.21 U/mL無顯著差異,說明模型可以很好的預測草莓酵素的發酵工藝。

2.4 草莓酵素貯藏期間抗氧化活性的變化

由圖3可知,草莓酵素在實驗的貯藏期內,體外抗氧化能力總體呈現下降趨勢。草莓酵素在貯藏初期羥自由基清除率(3A)、DPPH自由基清除率(3B)、超氧陰離子自由基清除率(C)和還原力(D)分別為79.38%、88.89%、74.40%和0.542;在4 ℃和室溫下貯藏12 d后,羥自由基清除率(3A)分別下降至70.48%和69.08%,DPPH自由基清除率(3B)分別下降至84.94%和85.51%,超氧陰離子自由基清除率(C)分別下降至57.15%和58.69%,還原力(D)分別下降至0.205和0.137。

圖3 貯藏過程中草莓酵素體外抗氧化能力的變化Fig.3 Changes of antioxidant activity of strawberry-Jiaosu in vitro during fermentation注:A：羥基自由基清除率,B：DPPH清除率,C：超氧陰離子自由基清除率,D：還原力。

草莓酵素的抗氧化能力與其所含的小分子糖、多糖、多酚類化合物及SOD等活性成分含量有關。草莓酵素的體外的抗氧化能力可能與酵素內所含的VC、VE和多酚類化合物等抗氧化物質有關。隨著貯藏時間的延長,酵素體外抗氧化能力降低可能與酵素里的部分活性成分如VC、VE、多酚被氧化破壞和SOD失活有關。因此,酵素在貯藏期間的穩定性和酵素抗氧化能力下降的機制需進一步研究。

2.5 草莓酵素的酶活性

對草莓酵素中的SOD、脂肪酶和淀粉酶活力進行測定,結果如圖4所示。

圖4 草莓酵素中SOD、脂肪酶和淀粉酶活力Fig.4 The enzyme activity of SOD,lipase and amylase in strawberry-Jiaosu

從圖4可以看出,草莓酵素中SOD、脂肪酶和淀粉酶活力分別為35.4、11.2、3.26 U/mL。SOD活性較高,這表明草莓酵素較高的抗氧化能力與其SOD活性有關,具有較好的保健和美容功效;草莓酵素脂肪酶活力次之,表明其也有一定的助脂肪消化的功效;草莓酵素淀粉酶活性不高,對淀粉的助消化能力有限。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,以發酵劑添加量、發酵時間、發酵溫度為自變量,以SOD為響應值,通過響應面法優化并獲得了草莓酵素的最佳發酵工藝:接種量為1.5%、發酵時間為13.5 h、發酵溫度為35 ℃。體外抗氧化實驗研究結果顯示:草莓酵素具有羥自由基清除能力(79.38%)、DPPH自由基清除能力(88.89%)、超氧陰離子自由基清除能力(74.40%)和還原力(0.542),草莓酵素的體外抗氧化能力隨著貯藏時間的延長都有不同程度的降低。草莓酵素中酶活性測定表明,SOD活性最強,脂肪酶次之,淀粉酶活性最低。草莓酵素具有良好的開發應用潛力。

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