果梅綠原酸超聲 提取工藝及其抗氧化活性

王興娜,吳曉紅,周 惠，余 芳，王 帆,*,陳寶宏,*

(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014;2.江蘇經貿職業技術學院工程技術學院,江蘇南京 211168)

果梅(PrunusmumeSieb. Et Zucc)為薔薇科植物,又分為白梅、青梅和紅梅[1]。我國是果梅的原產地,也是適合種植果梅地域最廣的國家[2]。果梅具有很強的抗氧化能力[3-6],據Han[7]等2001年報道,果梅中的蘆丁具有較強的抗氧化能力,Yan等[8]2014年報道果梅中的綠原酸具有清除過氧化氫自由基的能力。

正是由于綠原酸具有抗氧化等多種生物功能[10-15],是國際公認的“植物黃金”,需要從植物中提取出來;而在加工過程中,綠原酸很容易與蛋白質中的極性基團結合,影響蛋白的色澤,降低了果品的營養價值[16],這就需要在加工前把綠原酸去除,因此研究綠原酸的提取工藝無論在醫藥行業還是食品加工業都是很有必要的。

綠原酸含量高的植物有杜仲(樹皮中可達5%)、金銀花(花中可達5%)、向日葵(籽實中可達3%)、咖啡(咖啡豆中可含2%)、菊花(0.2%)。綠原酸提取方法主要有兩種,分別是水提法和有機溶劑提取法。其中杜仲葉綠原酸水提法的最佳工藝條件為:溫度60 ℃,料液比(g∶mL)1∶15,提取時間3 h[17]。水提法還有纖維素酶輔助法[16,18-19]。目前還是以乙醇提取法使用較多。杜仲葉中綠原酸乙醇提取法的最佳提取工藝為:乙醇濃度40%,料液比(g∶mL)1∶35,超聲波時間30 min,浸泡時間60 min,此條件下綠原酸的得率為8.0418 mg/g[20]。乙醇提取法多以超聲輔助提取[21-27]。目前尚未見果梅中綠原酸提取工藝研究的報道。

本文擬采用超聲波輔助乙醇提取果梅果肉中綠原酸,對其工藝進行優化,并在前期研究[5]的基礎上,用蘆丁作陽性對照,用氧化自由基吸收能力(ORAC)為指標，對果實中綠原酸的抗氧化活性作進一步評價,以期為果梅中綠原酸的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

果梅 品種為軟條紅梅,采自國家果梅種質資源圃(南京);綠原酸標準品 南京景竹生物有限公司;AAPH(偶氮二異丁脒鹽酸鹽)、蘆丁標準品 美國Sigma公司;Trolox(水溶性維生素E) 美國Acros Organics公司;熒光素鈉、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、PBS、無水乙醇、NaOH試劑、稀硫酸等 均為國內分析純。

多功能酶標儀 Mirotek Laborsystem GmbH,Overath Germany;旋轉蒸發儀RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠;電子天平TE214S 德國賽多利斯股份公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;MP3002電子天平 上海恒平科學儀器有限公司;800-1離心機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV5500紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;控溫多用組織搗碎機 江陰市保利科研有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;微機型pH計 上?？祪x儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸的提取 果梅果實去核后每份10.0 g稱量好,剪碎、搗碎后加入不同體積、不同濃度的酸乙醇(用稀鹽酸和NaOH調整)浸泡24 h后,用300 W超聲波在不同溫度下輔助提取綠原酸20～60 min。綠原酸提取液在25 ℃經4000 r·min-1離心10 min,取上層清液于25 mL容量瓶中,經多次洗滌離心后,用60%乙醇定容至刻度,取其中的1 mL用60%乙醇稀釋至25 mL,用紫外分光光度法在328 nm測定提取液的吸光值(A)。

1.2.2 綠原酸提取量的測定

1.2.2.1 綠原酸標準曲線繪制 配制系列濃度為0.0004、0.0008、0.0012、0.0016、0.002、0.0024、0.0028 mg·mL-1的綠原酸標準溶液。在328 nm處測定吸光度,以吸光度值A為縱坐標,以綠原酸標準溶液濃度C為橫坐標,繪制綠原酸標準曲線。

1.2.2.2 綠原酸提取量的計算 以對應濃度的乙醇溶液為空白對照。將A代入1.2.2.1得到的綠原酸標準曲線,得到稀釋后的綠原酸含量(C)。綠原酸提取含量η(mg/10 g)按以下公式計算:

η=C×25×25/M

式中,C-稀釋后綠原酸濃度(mg·mL-1);M-果梅肉鮮重(g);一個25為稀釋倍數;一個25為體積(mL)。

1.2.3 果梅肉綠原酸提取單因素實驗 準確取果梅果肉10.0 g,加入乙醇進行提取,分別以乙醇濃度、pH、料液比、超聲時間、超聲溫度、提取次數作為因素,每次以一個因素為變量,其它定量,分別測定提取液的吸光值,并計算綠原酸提取量。

1.2.3.1 乙醇濃度對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶6的比例分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,調pH=4。浸泡24 h后,在50 ℃下,300 W超聲30 min。共提取2次。

1.2.3.2 料液比對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8分別加入60%乙醇,調pH=4。浸泡24 h后,50 ℃用300 W超聲輔助提取30 min。共提取2次。

1.2.3.3 超聲時間對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比1∶6(g∶mL)加入60%乙醇溶液,調節pH=4。浸泡24 h后,分別在50 ℃用300 W超聲輔助提取20、30、40、50、60 min。共提取2次。

1.2.3.4 pH對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶6加入60%乙醇溶液,分別調pH=2、3、4、5、6。浸泡24 h后,在50 ℃用300 W超聲輔助提取30 min。共提取2次。

1.2.3.5 超聲溫度對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準確稱取果梅果肉10.0 g,5份,按料液比(g∶mL)1∶6分別加入60%乙醇溶液,調節pH=4。浸泡24 h后,300 W超聲輔助提取30 min,超聲溫度分別為20、30、40、50、60 ℃。共提取2次。

1.2.3.6 提取次數對果梅肉綠原酸提取效果的影響 準確稱取果梅果肉10.0 g,8份,按料液比(g∶mL)1∶7分別加入60%乙醇溶液,調節pH=4。浸泡24 h后,在50 ℃用300 W超聲輔助提取30 min。分別提取1、2、3、4、5、6、7、8次。

1.2.4 正交實驗 根據單因素實驗結果,按表1因素水平表進行正交實驗設計,以優化提取條件。每個處理重復三次。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 綠原酸氧化自由基的吸收能力(ORAC)測定 在96微孔板上加入100 μL不同濃度的綠原酸待測液,同時加入不同濃度的Trolox做對照,再用12道移液器在每孔中加入50 μL 200 nmol/L熒光素鈉混合,37 ℃反應15 min后,向每孔中加入50 μL 80 mmol/L的AAPH,誘發熒光淬滅。使用酶標儀的實驗設置參數為:激發波長485 nm,發射波長528 nm,37 ℃;循環數:35;循環周期:210 s;振蕩:8 s;振蕩幅度:4 mm。

ORAC值=[(AUC樣品-AUCAPPH)/(AUCTrolox-AUCAAPH)]×(MTrolox/M樣品)

式中,AUC-熒光衰退曲線下面積(Area under curve);M-摩爾濃度(Molarity)。

2 結果與分析

2.1 綠原酸標準曲線

由綠原酸溶液濃度(C)和吸光值(A)作圖,得線性方程為A=77.946C+0.005(R2=0.9987),線性范圍為0.0000～0.0028 mg/mL。

圖1 綠原酸吸光值與濃度變化曲線圖Fig.1 Variation curve of absorbance and concentration of chlorogenic acid

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 不同乙醇濃度對果梅肉綠原酸提取量的影響 由圖2可知,乙醇濃度由40%提高到60%,綠原酸提取量隨著濃度的增加而增加;從60%到80%,綠原酸提取量隨著濃度的增加而減少,60%乙醇浸泡提取得到的綠原酸量最高。鄧素蘭等[28]認為70%以上的乙醇溶液會引起綠原酸沉淀。

圖2 乙醇濃度對果梅果肉綠原酸提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.2.2 不同料液比對果梅肉綠原酸提取量的影響 由圖3可知,料液比(g:mL)為1∶7時經過兩次提取,提取得到15.3596 mg/10 g鮮重的綠原酸,是料液比(g:mL)為1∶9提取兩次得到綠原酸量(16.216 mg/10 g鮮重)的95%。在1∶7之前,隨著料液比的增大,綠原酸提取量較快增長;在1∶7之后,隨著液料比的增大,綠原酸提取增加量變化不大。由此可見,料液比為1∶7 (g∶mL)時,較節約且效率較高,可作為提取果梅中綠原酸合適的料液比。

圖3 料液比對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.2.3 不同超聲溫度對果梅肉綠原酸提取量的影響 從圖4可以看出,用60%乙醇浸泡果梅,然后不同溫度下超聲30 min,50 ℃前隨著超聲溫度的上升,提取的綠原酸含量也越來越多,在溫度為50 ℃時,提取量達到最大;隨后溫度越高,綠原酸提取量逐漸降低。

圖4 超聲溫度對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

因為綠原酸易溶解于熱水、乙醇,所以隨著溫度升高,提取量變大;但綠原酸的鄰二酚羥基結構不穩定,溫度過高時易氧化分解而使提取率下降,另一方面,在水介質中,超聲波產生的微射流對細胞表面產生沖擊、剪切,這需要密度與內壓比高,在爆破時能形成一定高溫與強壓梯度的氣泡,溫度較高時不利于氣泡的生成,也造成提取率下降。本實驗結果證明,50 ℃的超聲溫度較適合。

2.2.4 不同超聲時間對果梅肉綠原酸提取量的影響 從圖5可以看出,用60%乙醇浸泡果梅,隨著超聲時間變長,綠原酸提取量變高,但超過30 min后,隨著超聲時間加長,提取量反而下降,需要限定超聲時間為30 min。

圖5 超聲時間對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

若要從植物中提取活性成分,需要破碎細胞壁或打通溶劑進入細胞內的通道。細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素及木質素,而超聲波能很好的降低纖維素的結晶度和聚合度,打開結晶區,同時使半纖維素部分水解,并除去木質素的包裹,打通溶劑進入細胞內的通道,使提取時間縮短,提高綠原酸的提取率,所以30 min內,超聲有利于綠原酸的提取。但超聲提取時間過長,容易產生熱效應,導致綠原酸發生降解[29],所以綠原酸的提取量又開始下降。

2.2.5 不同pH對果梅果實綠原酸提取量的影響 從圖6可知,綠原酸提取量先隨著pH的增大而增大,在pH=4時達到最大提取量,隨后,隨著pH的增大而減小?？梢妏H=4的60%乙醇提取綠原酸效果最佳。因為綠原酸為酚酸類化合物,在酸性條件下,有利于其溶出,并且酸性條件能使原料的細胞壁軟化,因此,一般用酸乙醇進行提取。

圖6 pH對提取果梅果肉中綠原酸的影響Fig.6 Effect of pH value on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.2.6 不同提取次數對綠原酸提取量的影響 從圖7可以看出,在最佳單因素條件下,提取8次時,綠原酸的累積提取量為20.3 mg/10 g鮮重;提取次數3次時,提取到的綠原酸的量為19.8 mg/10 g,占8次總提取量的97.4%。因此,如果為節約時間和成本,一般提取3次即可。

圖7 提取次數對提取果梅中綠原酸的影響Fig.7 Effect of extraction times on the extraction of chlorogenic acid from Prunus mume

2.3 正交實驗結果分析

由表2正交實驗均值可以得出提取工藝的最佳組合為A2B2C2D2E2F3,可知,綠原酸的最佳提取工藝是乙醇濃度為60%(A2),料液比(g∶mL)為1∶7(B2),pH為4(C2),超聲時間為30 min(D2),超聲溫度為50 ℃(E2),提取次數為4次(F3)。由極差分析結果可以看出,提取次數對果梅果實中綠原酸提取量影響最大,料液比次之,超聲溫度、pH、乙醇濃度、超聲時間的影響依次減弱。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

驗證實驗表明,在乙醇濃度為60%,料液比(g∶mL)為1∶7,pH為4,超聲時間為30 min,超聲溫度為50 ℃時,提取3次、4次、8次時綠原酸的提取量分別為19.8 mg/10 g鮮重、20.0 mg/10 g鮮重、20.3 mg/10 g鮮重,3次、4次綠原酸的提取量分別占8次的97.4%和98.5%,考慮到3次、4次綠原酸的提取量差異小,加之時間與經濟成本,因此,確定提取3次。最終確定最佳組合為A2B2C2D2E2F2,即乙醇濃度為60%(A2),料液比(g:mL)為1∶7(B2),pH為4(C2),超聲時間為30 min(D2),超聲溫度為50 ℃(E2),提取次數為3次(F2),此時綠原酸提取量為19.8 mg/10 g鮮重。

2.4 綠原酸ORAC測定

ORAC法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由源,熒光素鈉為熒光指示劑,Trolox為定量標準,用酶標儀進行分析。經測定,綠原酸與蘆丁的ORAC值如表3。

表3 蘆丁和綠原酸的ORAC值Table 3 ORAC values of chlorogenic acid and rutin

從表3的回歸方程及相關系數可見,蘆丁和綠原酸的濃度與(AUC樣品-AUCAPPH)之間都存在良好的線性相關?；貧w方程的曲線斜率可以表示各自的抗氧化能力,ORAC值就是各樣品曲線斜率與Trolox曲線斜率的比值。經計算,綠原酸比蘆丁的ORAC值有顯著差異(0.01

3 結論

根據正交實驗和單因素實驗結果,最終確定果梅肉中綠原酸提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度 60%、料液比(g∶mL)為1∶7、pH為4、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃、提取次數3次。在此提取工藝條件下,得到的綠原酸量為19.8 mg/10 g鮮重。提取過程中,除提取次數和料液比的控制很重要,可以提高綠原酸的提取量外,超聲溫度、pH的控制也非常重要。

經測定發現,綠原酸的氧化自由基清除能力比蘆丁強很多?？梢?綠原酸在果梅中含量較高,而其對多種類型的氧化源都具有較強抗氧化能力,因此綠原酸可以作為果梅中一個重要的抗氧化功能成分加以研究。

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