響應面法優化超聲波-微波 協同提取龍眼殼總黃酮

曾俊美,鄭啟翔,劉杰鳳,羅劍斌,李 穎,*

(1.廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術開發中心,廣東茂名 525000;2.茂名市水果科學研究所,廣東茂名 525000)

龍眼(DimocarpuslonganLour.)為無患子科植物,俗稱桂圓,原產于我國南部和越南北部的南亞熱帶地區[1]。在龍眼加工過程中會產生大量的下腳料龍眼殼,造成巨大浪費,據邱松山等[2]報道龍眼殼中含有豐富的多糖、多酚、黃酮類化合物等生物活性成分。黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中,具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、抗氧化抗衰老、抑菌抗病毒和免疫調節等作用,是天然的甜味劑、抗氧化劑和色素[3-4]。

目前,已有少數研究龍眼殼總黃酮的提取方法,如:宋佳玉等[5]采用85%乙醇回流提取龍眼殼總黃酮,加熱回流提取3次得到龍眼殼總黃酮提取率約為4.17%;黃鎖義等[6]采用超聲波乙醇浸提法從龍眼殼中提取黃酮類物質,測得樣品中總黃酮的含量1.101 mg/mL;劉煥云等[7]研究了微波輔助龍眼殼總黃酮工藝,在最佳工藝條件下總黃酮得率為3.465%,但這些方法存在提取時間長,提取效率不高等問題,超聲波-微波協同技術[8-10]利用微波場的熱效應及生物效應來加速物質地擴散與溶解,同時當一定頻率的超聲波作用于溶液時,將會產生空化作用,溶液中尺寸適宜的小氣泡會發生共振現象,超聲空化對細胞壁產生機械的修剪力,使細胞壁破裂,并且,超聲可促進溶劑和活性成分的雙向轉移[11],因此具有能耗低,效率高,不破壞有效成分等優點。近幾年在黃酮等生物活性物質提取方面得到了迅猛發展。

本研究以龍眼殼為試材,采用超聲波-微波協同提取龍眼殼總黃酮,在單因素實驗基礎上采用響應面分析法優化工藝條件,為實際生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮龍眼 產于廣東省茂名市,手工剝殼,60 ℃烘干粉碎過40目篩后備用;蘆丁標準品 純度98%，上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為分析純。

XFB-200高速中藥粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠;DGG-9146A型鼓風干燥箱 廣州市德科生物科技有限公司;UV-5500pc紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BILON-ZCW-1000W紫外超聲波微波協同萃取儀 上海比朗儀器制造有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍眼殼總黃酮的提取工藝流程 龍眼殼→粉碎(40目)→超聲波-微波協同提取→抽濾→真空濃縮→鼓風干燥(60 ℃,8 h)→龍眼殼粗黃酮提取物

1.2.2 單因素實驗 稱取龍眼殼干粉若干份于三口平底燒瓶中,每份2.00 g,以總黃酮提取率為指標,固定微波功率500 W,依次改變超聲波功率、液料比、乙醇體積分數、提取時間和溫度,實驗方法如下:

超聲波功率:按液料比30 mL/g加入體積分數50%的乙醇溶液,在50 ℃條件下分別于超聲波功率0、100、200、300、400、500 W提取7 min。

液料比:分別按液料比15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g加入體積分數50%的乙醇溶液,在50 ℃條件超聲(100 W)提取7 min。

乙醇體積分數:按液料比30 mL/g分別加入體積分數40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液,在50 ℃條件超聲(100 W)提取7 min。

提取時間:按液料比30 mL/g分別加入體積分數50%的乙醇溶液,在50 ℃條件分別超聲(100 W)提取3、5、7、9、11 min。

提取溫度:按液料比30 mL/g分別加入體積分數50%的乙醇溶液,分別在30、40、50、60、70 ℃條件超聲(100 W)提取7 min。

1.2.3 響應面分析法對龍眼殼總黃酮提取工藝的優化 根據單因素實驗果,選取液料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)三個影響顯著的因素為響應實驗的3個因素,以總黃酮提取率為實驗指標,采用統計軟件Design-Expert中的響應曲面法建立三因素三水平的Box-Behnken模型對龍眼殼總黃酮提取工藝進行優化,實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗優化的因素及水平Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

1.2.4 蘆丁標準曲線的制作 準確稱取經105 ℃烘干至恒重的蘆丁標準品5.00 mg,用60%乙醇溶解后,定容至100 mL容量瓶內,搖勻,即得0.10 mg/mL的蘆丁標準溶液。精確吸取蘆丁標準溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于25 mL容量瓶中,各加入0.75 mL質量分數為5%的NaNO2,混勻,放置6 min后加入0.75 mL質量分數為10%的Al(NO3)3,搖勻,放置6 min后再加入10.00 mL質量分數為4%的NaOH,然后用60%乙醇溶液稀釋定容至刻度,搖勻靜置12 min。以不含蘆丁標準品的試劑作空白對照,在波長為508 nm處測定其吸光度。以蘆丁標準品濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,進而計算回歸方程。蘆丁標準曲線方程為:Y=13.35X+0.0005,R2=0.9999,由數據可以分析得出標準品具有良好的線性關系。

1.2.5 龍眼殼總黃酮含量的測定 精確吸取0.50 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中,按1.2.2步驟加入各溶液,搖勻,靜置12 min,以不含樣品溶液的試劑作空白對照,在508 nm波長處測定其吸光度。

1.2.6 總黃酮提取率的計算 對龍眼殼提取液進行吸光度測定,由蘆丁標準曲線方程計算求得總黃酮含量,進而根據溶液體積計算出提取得到的龍眼殼總黃酮含量,根據下列公式(1)計算龍眼殼總黃酮提取率[8]:

總黃酮提取率(%)=(C×25×100)/(0.5×m×1000)×100

式(1)

式中:C-蘆丁濃度,mg/mL;m-龍眼殼質量,g。

1.3 數據統計分析

使用Excel軟件對實驗數據進行ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波功率對龍眼殼總黃酮提收率的影響

超聲波功率對龍眼殼總黃酮提取率的影響結果見圖1。由圖1可知,當超聲波功率小于100 W時,總黃酮提取率隨超聲波功率的增加而增大,而當超聲波功率大于100 W后,總黃酮提取率呈下降趨勢,這可能是因為超聲波作用加速了龍眼殼中的黃酮類物質進入溶劑,從而增加了總黃酮提取率;但超聲波功率過大,黃酮類物質可能發生分解導致提取率下降[6],因此選擇最佳超聲波功率為100 W。

圖1 超聲波功率對總黃酮提取率的影響Fig.1 The influence of ultrasonic wave power on the yield of total flavonoids

2.2 液料比對龍眼殼總黃酮提取率的影響

液料比對龍眼殼總黃酮提取率的影響結果見圖2。由圖2可知,當液料比低于30 mL/g 時,隨著液料比的增大,總黃酮的提取率逐漸增加,這是因為增大液料比促進了龍眼殼粉末顆粒與溶劑之間的接觸面,降低了黃酮類物質向溶劑中溶出的阻力,使得總黃酮提取率增加;當液料比大于30 mL/g時,隨著液料比的繼續增加,總黃酮的提取率反而有所下降,這是因為溶劑用量過大,過多的溶劑會對微波、超聲波產生一定的吸收,影響龍眼殼對能量的吸收,也可能是因為溶劑體積過大時傳質過程受到影響[12-13]。綜上選擇最佳液料比為30 mL/g。

圖2 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.2 The influence of liquor-material ratio on the yield of total flavonoids

2.3 乙醇體積分數對龍眼殼總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數對龍眼殼總黃酮提取率的影響結果見圖3。由圖3可以看出,當乙醇體積分數小于50%時,總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增大而增加,而當乙醇體積分數大于50%后,提取率呈下降趨勢。其原因可能是乙醇體積分數太小會造成提取不完全,而乙醇體積分數過高時,一些脂溶性的物質的溶出量增大,使得黃酮類物質的溶解度降低[14],從而導致龍眼殼黃酮類化合物提取率降低,因此選擇體積分數為50%的乙醇溶液為最適提取液。

圖3 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.3 The influence of Volume fraction of ethanol on the yield of total flavonoids

2.4 提取時間對龍眼殼總黃酮提取率的影響

提取時間對龍眼殼總黃酮提取率的影響結果見圖4。由圖4可知,龍眼殼中總黃酮提取率隨超聲波微波協同提取時間的延長先增大后減少,當提取時間為5 min時總黃酮提取率達到最大,但當提取時間大于5 min,隨著時間的增加總黃酮提取率有所降低,這可能是由于當超聲波微波處理時間大于5 min時,會使黃酮類物質發生分解,致使總黃酮提取率略有下降[9,15-16],也可能是由于樣品中的蛋白質分子吸收了足夠的熱量而發生變形凝聚,阻礙了提取溶劑與黃酮之間的傳質作用[10]。因此選擇最適提取時間為5 min。

圖4 提取時間對龍眼殼總黃酮提取率的影響Fig.4 The influence of extraction time on the yield of total flavonoids of longan shell

2.5 提取溫度對龍眼殼總黃酮提取提取率的影響

提取溫度對龍眼殼總黃酮提取率的影響結果見圖5。由圖5可以看出,隨著溫度不斷升高,龍眼殼總黃酮的提取率不斷增加,當溫度低于60 ℃時,總黃酮提取率隨溫度增加顯著增長,當溫度超過60 ℃時,繼續升溫,總黃酮提取率呈緩慢下降的趨勢,這可能是因為高溫使溶劑粘度降低,分子運動加快,從而加快生物活性物質的溶出,但溫度過高會使得熱敏性化合物降解為小分子化合物,導致得率降低[17]。因此選擇最佳提取溫度為60 ℃。

圖5 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 The influence of microwave heating temperature on the yield of total flavonoids

2.6 響應面實驗安排及結果

響應面實驗方案及結果見表2。實驗號13～17為5個中心實驗,用以估計實驗誤差,其他為析因實驗。

表2 優化實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert軟件進行數據處理,建立二次響應面回歸模型,方差分析結果見表3,響應面圖見圖6。

表3 擬合回歸方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖6 兩因素交互作用對龍眼殼總黃酮提取率的響應面圖和等高線圖Fig.6 The response surface map and contour map drawn from two-factor interactions on the yield of total flavonoids of longan shell注：固定水平:微波功率500 W;超聲波功率100 W;乙醇體積分數50%。

各因素經回歸擬合后,得到回歸方程如下:

Y=3.07-0.065A-0.20B-0.083C+0.020AB-0.16AC-0.16BC-0.21A2-0.31B2-0.20C2

式(2)

通過對響應面回歸方程的分析確定最佳超聲波-微波協同提取龍眼殼中總黃酮的工藝參數為液料比為29.19∶1 mL/g、提取溫度為56.82 ℃、提取時間為4.96 min,考慮到實際操作中的局限性,對最佳工藝條件進行如下修正:液料比為29.2∶1 mL/g、提取溫度57 ℃、提取時間5 min。此條件下由公式(2)算出的龍眼殼總黃酮提取率的理論值為3.108%。根據所得的分析數據進行三組重復驗證實驗,得到龍眼殼總黃酮的平均提取率為3.06%,測定結果穩定,與理論預測值接近,說明該模型有效。

3 結論

本文考察了龍眼殼總黃酮的超聲波微波協同提取工藝,通過單因素實驗考察了超聲波功率、液料比、乙醇體積分數、提取時間和溫度五個因素對總黃酮提取率的影響,應用Box-Behnken響應面法優化得到最佳的提取工藝條件:超聲波功率為100 W,液料比為29.2∶1 mL/g,乙醇體積分數為50%,提取溫度為57 ℃,提取時間為5 min,在此條件下測得龍眼殼的總黃酮提取率為3.06%,該工藝條件可對龍眼殼相關研究提供參考和依據。

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