響應面優化維吾爾調和茶 提取工藝及抗氧化活性

張 良,陸銀銀,曹玉鳳,3,陳 亮,張建梅,沈 婷,馮作山,白羽嘉,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.淮陰師范學院生命科學學院,江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室,江蘇淮安 223300;3.江蘇大學生命科學研究院,江蘇鎮江 212013)

維吾爾調和茶是維吾爾保健茶類的一種,2014年被列入新疆第四批《自治區級非物質文化遺產》名錄。維吾爾調和茶是維吾爾民族在日常生活中結合維吾爾醫藥學總結出的以茶為主要原料,配以多種藥食兩用材料的調和茶,這種茶沖泡飲用后可以養胃健脾、提神醒腦、強身健體。維吾爾族人把維吾爾調和茶看作“既是一種營養食品,又是一種保健飲料”,每天伴隨三餐飲用。許多地方還流行著這樣一句俗語:寧可一日無米,不可一日無茶[1]。千百年的傳承使得這種獨具西域風味的維吾爾調和茶具有較高的安全性,但相關研究較少,主要集中在茶文化[2-4]。國內外關于維吾爾調和茶制備工藝和抗氧化活性方面的分析還未見報道。

復(混)合茶飲料是以茶葉和植(谷)物混合加工制成的,具有茶與植(谷)物混合風味的液體飲料。南方氣候濕熱,為了解暑祛濕,形成了眾多涼茶配方[5];北方冬季多寒冷,為了祛風散寒,配伍出多種保健茶和調和茶,再適量添加食品添加劑使調和茶更加美味[6]。不同類型的復(混)合茶浸提方式不同,有熱浸泡法、低溫緩萃取法、逐步升溫分段萃取法、超聲輔助浸提法、微波輔助浸提法等[7-8]。在《GB/T 21733-2008茶飲料》中還規定了復(混)合茶飲料茶多酚含量應≥150 mg/kg[9]。本研究的維吾爾調和茶以茯磚茶為主要原料,配以多種植物原料,采用經典熱浸泡法浸提,再利用響應面設計實驗,通過多酚含量確定最佳工藝參數,對提高原料利用率、節約資源、降低成本有著極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維吾爾調和茶 印度豆蔻1.5 g、紅花3 g、玫瑰花3 g、丁香0.3 g、薄荷2 g、小茴香1.5 g、甘草1 g、干姜0.3 g、姜黃0.5 g、茯磚茶15 g,購自安徽亳州；原料粉碎后過18目篩,混合均勻,置于干燥處保存。二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)、二銨鹽(ABTS)、沒食子酸 Sigma公司;福林酚、無水碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸、無水乙醇 均為分析純。

BT25S分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;5810R臺式高速冷凍離心機 德國eppendorf;Infinite M200 Pro酶標儀 瑞士Tecan;DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制作 準確稱取沒食子酸0.100 g,用重蒸餾水溶解后定容至100 mL,得到1 mg/mL沒食子酸標準溶液。

參照國標《GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》的方法[10],用重蒸餾水配制不同質量濃度的沒食子酸標準溶液(0、15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL),各吸取20 μL加入96孔板后加100 μL的20%福林酚試劑,反應3～8 min,加入80 μL 1 mol/L Na2CO3溶液,用酶標儀搖動1 min,混勻放置30 min后測A760 nm。以沒食子酸質量濃度為橫坐標,A760 nm為縱坐標,繪制沒食子酸標準曲線,標準方程Y=0.0051X+0.0243,R2=0.9996。式中:Y為吸光度;X為總酚質量濃度(μg/mL)。

1.2.2 維吾爾調和茶總酚提取量的測定 維吾爾調和茶提取過濾后,取濾液20 μL,按照標準曲線的測定方法,測定樣品的A760 nm,根據回歸方程計算維吾爾調和茶濾液中總酚的提取量,如式(1)所示:

式(1)

式中:ρ為總酚質量濃度(mg/mL);V為提取液體積(mL);M為維吾爾調和茶質量(g)。

1.2.3 維吾爾調和茶總酚提取的單因素實驗 精確稱取(0.50±0.01) g混合均勻的維吾爾調和茶樣品于50 mL離心管中,按料液比為1∶50 (g/g)的比例加入25 g去離子水混勻,在80 ℃的水浴鍋中分別恒溫浸提5、15、25、35、45 min,研究浸提時間對維吾爾調和總酚提取量的影響;再以料液比為1∶50 (g/g)的比例加入25 g去離子水混勻浸提,分別于50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋中恒溫浸提25 min,探究浸提溫度對維吾爾調和總酚提取量的影響;最后按料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 (g/g)依次加入去離水混勻后在80 ℃的水浴鍋中恒溫浸提25 min,探究料液比對維吾爾調和總酚提取量的影響。

1.2.4 響應面分析法優化工藝條件 根據單因素實驗結果,利用Design-Expert 8.0.6Trial軟件進行響應面分析,優化維吾爾調和茶總酚的提取工藝,實驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素和水平Table 1 Variables and levels in Box-Behnken

1.2.5 體外抗氧化能力測定

1.2.5.1 配制不同稀釋梯度的維吾爾調和茶提取液 準確稱取0.500 g混勻后的維吾爾調和茶原料,用響應面法所得最佳工藝參數提取,取1 mL提取液配制成不同稀釋梯度的維吾爾調和茶提取液。

1.2.5.2 Fe3+還原能力的測定 取0.2 mL不同濃度的受試物溶液,與0.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mmol/L,pH6.6)和0.5 mL鐵氰化鉀溶液(1.0%,質量分數)混勻,50 ℃孵育30 min,迅速冷卻,加入0.5 mL三氯乙酸溶液(10%,質量分數),混合后3000 r/min離心10 min,取上清液0.5 mL,加入0.5 mL純水和0.1 mL三氯化鐵溶液(0.1%,質量分數),混勻,測定混合物溶液在700 nm處的吸光度。吸光度值越大,表示受試物的還原能力越強。

1.2.5.3 清除ABTS+自由基的測定 用PBS(pH=7.4)配制7 mmol/L的ABTS溶液,將7 mmol/L的ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀等體積混勻,在室溫下避光反應12 h生成ABTS+儲備液,使用前用PBS稀釋到734 nm波長處吸光度為0.66±0.03的工作液。取不同濃度的受試物溶液20 μL加到96孔透明酶標板中,分別加入150 μL 0.2 mmol/L ABTS+儲備液,以PBS作為對照,室溫下反應10 min后,在波長517 nm處測其吸光值。ABTS+自由基清除率如式(2)所示：

式(2)

式中:A0-無水乙醇與ABTS+溶液混合后的吸光度;A1-待測液與ABTS+溶液混合后的吸光度;A2-待測液與無水乙醇混合后的吸光度。

1.2.5.4 清除DPPH自由基的測定 取100 μL不同濃度的受試物溶液加到96孔透明板中,再分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法,將不同濃度的樣品液分別與甲醇混勻作為空白組,DPPH溶液與甲醇混勻作為對照組。室溫避光放置30 min后,在波長517 nm處測其吸光值。DPPH自由基清除率如式(3)所示：

式(3)

式中:A0-DPPH乙醇溶液與無水乙醇混合后的吸光度;A1-待測液與DPPH乙醇溶液混合后的吸光度;A2-待測液與無水乙醇混合后的吸光度。

1.3 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對總酚提取量的影響 由圖1可知,維吾爾調和茶總酚提取量隨著提取時間的延長而升高,當提取時間到25 min時達到最高,最大浸提量為(42.42±0.45) mg/g,隨著時間的繼續延長，總酚提取量反而呈下降趨勢,到45 min時總酚浸提量下降到(34.45±0.69) mg/g,這可能是由于長時間的高溫導致部分多酚類物質發生氧化,故選擇25 min作為維吾爾調和茶的最佳提取時間。

圖1 提取時間對總酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction duration on yield of polyphenols

2.1.2 提取溫度對總酚提取量的影響 由圖2可知,隨著提取溫度的升高,維吾爾調和茶總酚提取率不斷升高,當提取溫度達到80 ℃時,酚類物質提取量最高,為42.42±0.46 mg/g,這是由于溫度升高可以加快分子間運動速率,進而增大酚類物質溶出。當溫度升到90 ℃時總酚提取量略有下降,為40.32±0.80 mg/g,可能是由于維吾爾調和茶中酚類物質含有不穩定化合物,溫度過高被氧化造成的,故選擇80 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對多酚提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of polyphenols

2.1.3 料液比對總酚提取量的影響 由圖 3 可知,隨著料液比的增大酚類物質提取量逐漸升高。當料液比在1∶50、1∶60和1∶70 (g/g)時,酚類物質提取量分別為(42.62±0.39)、(43.13±0.46)、(42.24±0.84) mg/g,這主要是由于溶劑中溶質濃度差逐漸在增大,使得酚類物質溶解量也不斷升高。當料液比從1∶50增大到1∶60時,酚類物質含量只增大了1.20%,沒有顯著差異,從節約成本方面考慮,故選擇料液比為1∶50 (g/g)。

圖3 料液比對多酚提取率的影響Fig.3 Effect of liquid to substrate ration on yield of polyphenols

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 Box-Behnken實驗設計及結果 采用Design-Expert V8.0.6軟件,在單因素實驗的基礎上,以總酚提取量為響應值,根據Box-Behnken實驗設計原理,設計三因素三水平響應面實驗,實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析 從方差分析表3可知,由實驗數據所得模型的F值為13.2874,p值為0.0054,表示該模型極顯著。由模型擬合所得回歸方程:Y=46.86+0.63A+2.58B+1.07C-0.21AB+1.53AC+1.15BC-3.80A2-2.78B2-2.32C2。方程中極顯著項有一次項B,二次項A2、B2(p<0.01),方程中顯著項有二次項C2,交互項AC(p<0.05),而一次項A、C和交互項AB、BC均不顯著(p>0.05),且影響維吾爾調和茶總酚提取量的因素依次是:提取溫度(B)>料液比(C)>提取時間(A)。由此可知,各影響因素與響應值并不是簡單的線性關系。該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系,可以用其確定最佳提取工藝條件。

2.2.3 響應面分析與工藝優化 根據提取時間、提取溫度和料液比3個因素及其交互作用對維吾爾調和茶總酚提取量的影響,繪制三維空間的曲面圖,如圖4所示。曲面圖直觀地反映了各因素對響應值的影響,均呈二次方程關系。圖中等高線形狀可反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表明交互作用不顯著,圖4a,圖4b,圖4c的等高線圖表明溫度、時間和料液比三者之間均有交互作用,交互作用的影響可能導致響應面預測最佳值與單因素最佳值相對偏移。

圖4 任意兩變量對總酚提取率影響的響應曲面圖Fig.4 Response surface plots for the effects of any two variables on extraction rate of polyphenols

確定回歸模型預測的最優提取工藝為:提取時間24 min、提取溫度85.5 ℃、料液比1∶54 (g/g),維吾爾調和茶總酚提取量理論值為47.64 mg/g。為檢驗該最優提取工藝的可靠性,進行驗證實驗,得到總酚提取量為(46.86±0.814) mg/g。維吾爾調和茶總酚提取量的驗證值與理論值較接近,因此認為利用響應面法優化維吾爾調和茶總酚提取量的提取工藝有效可行。

2.3 體外抗氧化活性測定結果

2.3.1 Fe3+還原能力 三價鐵離子還原法測定物質的還原能力，常用于天然產物抗氧化活性的評價。該方法簡單靈敏、快速方便,結果具有較高的可重復性,比較適用于混合天然產物還原能力的體外測定[11-12]。VC和維吾爾調和茶的還原能力如圖5所示,它們均具有一定的還原力,且還原力隨著體系質量濃度的增大而增強,呈明顯的量效關系。10 mg的維吾爾調和茶就相當于100 μg的VC的還原力,維吾爾調和茶中含有薄荷、丁香、小茴香等多種植物,它們都有較強的還原力,所以維吾爾調和茶擁有較強的還原能力。

圖5 維吾爾調和茶Fe3+還原能力Fig.5 Uighur medicinal tea Fe3+ reduction ability

2.3.2 對ABTS+自由基的清除作用 ABTS+自由基陽離子在水溶液中具有較好的溶解性,可用于水溶性天然產物抗氧化活性的測定。該方法簡單快捷,無需復雜的反應步驟及苛刻的反應條件,可測定酸性、中性及弱堿性化合物的自由基清除能力[13-15]。VC和維吾爾調和茶的ABTS+自由基的清除作用如圖6所示,維吾爾調和茶在濃度達到100 mg/mL時對ABTS+自由基的清除率接近100%,且VC和維吾爾調和茶的IC50分別是:159.233 μg/mL和30.837 mg/mL,表明維吾爾調和茶中含有的大量的藥食兩用材料具有良好的ABTS+自由基清除活性。

圖6 維吾爾調和茶對ABTS+自由基清除率Fig.6 ABTS+ free radical scavenging rate for Uighur medicinal tea

2.3.3 對DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基清除實驗是一種簡單有效、經濟可靠的方法,其結果重復性好,受環境因素影響較小,自由基穩定,靈敏度高,無需其它復雜反應,在517 nm下有最大吸收峰,被廣泛地應用于天然分子自由基清除活性的測定反應中[16-18]。VC和維吾爾調和茶的DPPH自由基的清除作用如圖7所示,隨著它們的濃度的增加,對DPPH自由基的清除率也在逐漸增大,且有明顯的量效關系。VC和維吾爾調和茶的IC50分別是11.685 μg/mL和13.399 mg/mL,表明維吾爾調和茶具有良好的DPPH自由基清除活性。

圖7 維吾爾調和茶對DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging rate for Uighur medicinal tea

3 結論

本文以總酚提取量為指標,用Box-Behnken實驗設計原理優化了維吾爾調和茶的浸提工藝,最終確定了其最優提取工藝為:提取時間24 min、提取溫度85.5 ℃、料液比1∶54 (g/g)。在最優工藝下,維吾爾調和茶的總酚浸出量為(46.86±0.814) mg/g,與預測值基本一致,為今后維吾爾調和茶的工廠化生產和企業標準奠定了基礎。

維吾爾調和茶具有較好的抗氧化活性,10 mg的維吾爾調和茶就相當于100 μg VC的還原力,對ABTS+、DPPH自由基的IC50分別是30.837、13.399 mg/mL,表明維吾爾調和茶具有較好的清除自由基的能力,為維吾爾調和茶的市場開發潛力指明道路。

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