厚樸葉脫色及染色工藝的優(yōu)化

郭香鳳,史國安,,*,徐金龍,3,程建強(qiáng),齊國亮

(1.河南科技大學(xué),河南洛陽 471023;2.洛陽百合輕工業(yè)有限公司,河南省葉類制品工程技術(shù)研究中心,河南洛陽 471400;3.鄭州安圖綠科生物工程有限公司,河南鄭州 450003)

厚樸(MagnoliaOfficinalls)為傳統(tǒng)中藥材,在我國已有2000多年的藥用歷史[1]。歷代主要本草所載正品厚樸其藥用部位均為樹皮,亦有厚樸花蕾入藥的記載,未見有以葉入藥的記載。一般要求厚樸生長15年以上才能用于剝皮藥用[2],厚樸藥材的主要采收方式是靠砍樹剝皮。

厚樸是一種高大落葉喬木,其藥用和觀賞價(jià)值受到廣泛的重視。近年來,全國厚樸種植面積大增,厚樸生長周期相對較長,全國厚樸葉的蘊(yùn)藏量每年可達(dá)30萬噸以上,而且每年可以再生,但是厚樸葉未能充分利用,造成了資源的浪費(fèi)[3]。厚樸葉含有厚樸的主要有效成分厚樸酚等生理活性物質(zhì)[3-6],有抗氧化、抗炎、抗生素和抗痙攣等作用。

由于厚樸葉葉形獨(dú)特,如芭蕉扇、香氣濃,經(jīng)過腌制保藏、蒸煮脫鹽、整形分級、真空包裝、殺菌等工序后,出口日本用于壽司飯的料理及燒烤襯墊物,作為食品包裝和裝飾材料,受到消費(fèi)者的歡迎[3,7-8]。厚樸葉采收后,運(yùn)至加工廠用鹽水腌制進(jìn)行長期保藏,用于后續(xù)的厚樸葉制品加工。而采后未經(jīng)特殊加工處理的植物葉在貯藏、加工、運(yùn)輸和使用的過程中,其內(nèi)部天然的葉綠素極易分解[9],造成葉片退色,影響了其使用價(jià)值。由葉綠素衍生得到的葉綠素銅鈉鹽,是一種水溶性好、安全無毒的天然食用色素[10]。通過蒸煮加工除去厚樸葉中不穩(wěn)定的葉綠素,用穩(wěn)定的葉綠素銅鈉鹽將其染色,把茶黃色厚樸葉的轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗑G色,從而使厚樸葉制品穩(wěn)定地保持其天然綠色。

厚樸葉作為一種食品包裝、裝飾材料,先用乙醇脫除不穩(wěn)定的葉綠素,再用天然的葉綠素銅鈉鹽染色恢復(fù)綠色[11-12],對提高厚樸葉制品的商品外觀質(zhì)量有重要意義。盡管青綠色厚樸葉制品有較好的市場應(yīng)用前景,但是葉綠素銅鈉鹽復(fù)染返綠厚樸葉的生產(chǎn)工藝研究未見報(bào)道。本研究分別以脫色殘液中的葉綠素含量和葉綠素銅鈉鹽的上染率為指標(biāo),通過單因素分析和正交實(shí)驗(yàn)得到最佳脫色及染色工藝條件,為厚樸葉資源利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食鹽 中鹽舞陽鹽化有限公司;20%食鹽水腌制的厚樸葉 洛陽百合輕工業(yè)有限公司;無水乙醇 分析純，煙臺市雙雙化工有限公司;葉綠素銅鈉鹽 山東樸正生物科技有限公司。

DK-526型恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)食品有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用食品有限責(zé)任公司。

1.2 脫色工藝優(yōu)化

1.2.1 厚樸葉中葉綠素脫除工藝 挑選大小、厚薄基本一致的葉片,用打孔器制成直徑均為8 mm的葉圓片,并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?0 mL三角瓶,稱取1.0 g厚樸葉圓片,乙醇溶液做脫色劑,按一定的料液比(m:v)放入三角瓶中,搖勻后封口,置于設(shè)定溫度的水浴鍋中保溫脫色。脫色結(jié)束將三角瓶取出置于室溫下冷卻。

1.2.2 葉綠素含量測定 將厚樸葉圓片取出后,用蒸餾水把脫色殘液定容至脫色前的體積，搖勻,吸取1 mL,用蒸餾水稀釋10倍,分別測定645 nm和663 nm波長下吸光值(A),以組織中葉綠素進(jìn)入脫色液的量表示組織中葉綠素的脫除效果。依據(jù)Arnon公式計(jì)算提取液中葉綠素總含量,即為葉綠素脫除量[13]:

葉綠素脫除量(mg/g):CT=(20.21×A645+8.02×A663)× 10×V

式中,V為脫色液體積。

1.2.3 脫除葉綠素的單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,影響脫除組織中葉綠素的主要因素有脫色溫度、脫色時(shí)間、乙醇濃度、料液比等,以葉綠素脫除量為指標(biāo),對以上4因子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

設(shè)定料液比1∶30 g/mL、脫色溫度70 ℃、脫色時(shí)間4 h,分別使用60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進(jìn)行脫色;

設(shè)定乙醇濃度80%、脫色溫度70 ℃、脫色時(shí)間4 h,分別按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的料液比進(jìn)行脫色;

設(shè)定乙醇濃度80%、料液比為1∶30 g/mL、脫色時(shí)間為4 h,分別在50、60、70、80和90 ℃條件下進(jìn)行脫色;

設(shè)定乙醇濃度80%、脫色溫度70 ℃,料液比1∶30 g/mL,分別處理2、3、4、5和6 h。

1.2.4 脫除葉綠素的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對乙醇濃度、料液比、脫色溫度和脫色時(shí)間進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn),確定脫除葉綠素的最佳工藝參數(shù),因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表(脫色)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment(decolorization)

1.3 復(fù)染工藝優(yōu)化

1.3.1 葉圓片葉綠素銅鈉鹽復(fù)染工藝 使用50 mL三角瓶,稱取1.0 g脫色厚樸葉圓片,以葉綠素銅鈉鹽溶液做染色劑,按一定的料液比(m:v)放入三角瓶中,搖勻后封口,置于設(shè)定溫度的水浴鍋中保溫處理一定時(shí)間。處理結(jié)束后將三角瓶取出置于室溫下冷卻。

1.3.2 上染率的測定 將復(fù)染的厚樸葉圓片取出后用蒸餾水把染后殘液定容至染色前的體積,吸取1 mL,用蒸餾水稀釋10倍后,以蒸餾水為空白,立即測定630 nm波長下的吸光值(A)。以染液中葉綠素銅鈉鹽殘留率表示組織的染色狀況。按下式計(jì)算上染率(Y)[13]:

Y(%)=(1-A/A0)×100

式中,A0、A分別為染色前、染色后染液的吸光值。

1.3.3 復(fù)染的單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,影響組織復(fù)染的主要因素有葉綠素銅鈉鹽濃度、染色溫度、染色時(shí)間、料液比,以上染率為指標(biāo),對以上4因子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

設(shè)定料液比1∶10 g/mL、染色溫度95 ℃、染色時(shí)間60 min,分別使用濃度為2、4、6、8和10 g/L的葉綠素銅鈉染色液進(jìn)行染色;

設(shè)定葉綠素銅鈉鹽濃度6 g/L、染色溫度為90 ℃、染色時(shí)間為60 min,分別按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL的料液比進(jìn)行染色;

設(shè)定葉綠素銅鈉鹽濃度6 g/L、料液比為1∶10 g/mL、染色時(shí)間為60 min,分別在80、85、90、95和100 ℃條件下進(jìn)行染色;

設(shè)定葉綠素銅鈉鹽濃度6 g/L、料液比為1∶10 g/mL、染色溫度為95 ℃,分別處理10、20、40、60和80 min進(jìn)行染色。

1.3.4 復(fù)染的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以葉綠素銅鈉鹽濃度、料液比、染色溫度和染色時(shí)間為因子,上染率為指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),因素水平見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表(染色)Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment(dyeing)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn),以p<0.05為差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚樸葉脫色工藝優(yōu)化

2.1.1 乙醇濃度對脫色效果的影響 葉綠素易溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑,考慮到安全性和成本因素,實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為色素脫除劑。圖1表明,在60%～80%濃度范圍內(nèi),脫色效果隨著溶劑濃度的增大而增大,在80%處達(dá)到最大值,隨后下降。由于葉片組織中葉綠素與蛋白質(zhì)結(jié)合,過高濃度的乙醇反而不利于葉綠素的脫離與溶出。選取濃度為70%、80%和90%的乙醇溶液進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖1 乙醇濃度對厚樸葉脫色的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on leaves decolorization of Magnolia officinalis注：*表示差異顯著(p<0.05)。圖2～圖5同。

2.1.2 料液比對脫色效果的影響 由圖2結(jié)果可知,在料液比為1∶10～1∶30 g/mL的范圍內(nèi),脫色效果隨著料液比的增大而迅速增大。當(dāng)料液比為1∶10 g/mL時(shí),由于溶劑不充分,葉綠素溶解不完全,對葉綠素脫除的效果有限。當(dāng)料液比由1∶10 g/mL提高至1∶30 g/mL,葉綠素脫除效果大幅提高,說明葉綠素由厚樸葉組織向脫色液擴(kuò)散的速率加快,充分溶解,脫除量增大。但增加到一定程度(1∶40) g/mL后趨于平穩(wěn),脫色效果增加不明顯,在1∶50 g/mL葉綠素總量值與1∶40 g/mL時(shí)無顯著差異,說明葉綠素的溶解速率達(dá)到平衡。綜合考慮成本因素,選取料液比1∶30、1∶40、1∶50 g/mL進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 料液比對厚樸葉脫色效果的影響Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on leaves decolorization of Magnolia officinalis

2.1.3 脫色溫度對脫色效果的影響 由圖3看出,厚樸葉葉綠素脫除量隨脫色溫度的升高呈先上升后下降趨勢。在50～70 ℃,脫色效果隨著處理溫度的提高而迅速提高,原因在于隨著溫度的提高,溶劑向原料內(nèi)部的擴(kuò)散速率增加,溶質(zhì)的溶出速度加快。達(dá)到80 ℃時(shí)略有下降,可能是葉綠素不穩(wěn)定,在高溫條件下發(fā)生分解,從而使測量的葉綠素總量值降低。當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí),溶液沸騰,在水浴條件下無法正常進(jìn)行實(shí)驗(yàn),因此選取溫度60、70、80 ℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 脫色溫度對厚樸葉脫色效果的影響Fig.3 Effect of temperature on leaves decolorization of Magnolia officinalis

2.1.4 脫色時(shí)間對脫色效果的影響 由圖4看出,隨著脫色時(shí)間的延長,脫色殘液中的葉綠素濃度先增大后減小,可能是葉綠素在高溫條件下長時(shí)間處理發(fā)生分解所致。在脫色時(shí)間為5 h時(shí),葉綠素脫除量最大。因此選取時(shí)間為3、4和5 h進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 脫色時(shí)間對厚樸葉脫色效果的影響Fig.4 Effect of time on leaves decolorization of Magnolia officinalis

2.1.5 脫色正交實(shí)驗(yàn) 由表3結(jié)果可知,影響厚樸葉脫色的各因素作用主次順序是:料液比>乙醇濃度>脫色溫度>脫色時(shí)間。厚樸葉脫色的最佳條件是A2B3C2D1,即乙醇溶劑濃度80%、料液比1∶50 g/mL、脫色溫度70 ℃、脫色時(shí)間3 h,恰為正交表中第九組實(shí)驗(yàn),此時(shí)葉綠素的最高脫除量為0.98 mg/g,厚樸葉轉(zhuǎn)變?yōu)榧儍舻牟杌ㄉＴ诖嘶A(chǔ)上,再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明該條件下厚樸葉色素的脫除量為0.97±0.04 mg/g。

表3 厚樸葉脫色研究正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiments designs of discolouring

2.2 厚樸葉染色工藝優(yōu)化

2.2.1 葉綠素銅鈉鹽濃度對染色效果的影響 由圖5可知,上染率隨著葉綠素銅鈉鹽濃度的增大而逐漸減小。結(jié)合觀察到的實(shí)際情況,原料在葉綠素銅鈉鹽濃度為2 g/L條件下所得成品為淡綠色,在葉綠素銅鈉鹽濃度為4 g/L條件下所得成品為青綠色,6、8、10 g/L條件下的染色效果逐漸增強(qiáng),但增強(qiáng)效果不明顯,無法用肉眼明顯區(qū)別差異。另外,結(jié)合生產(chǎn)成本考慮,選取濃度為4、6、8 g/L的葉綠素銅鈉鹽濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖5 葉綠素銅鈉鹽濃度對脫色厚樸葉染色效果的影響Fig.5 Effect of sodium copper chlorophyllin concentration on leaves dyeing of Magnolia officinalis

2.2.2 料液比對染色效果的影響 由圖6看出,上染率隨著料液比的增大而減小。結(jié)合觀察到的實(shí)際情況,原料在5個(gè)處理水平下染色效果都符合要求。在料液比為1∶20 g/mL和1∶25 g/mL的條件下,由于染料過濃厚樸葉圓片被染為深綠色,視覺效果變差,且使生產(chǎn)成本增大。因此,選取料液比為1∶5、1∶10、1∶15 g/mL的染液進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖6 料液比對脫色厚樸葉染色效果的影響Fig.6 Effect of ratio of solid to liquid on leaves dyeing of Magnolia officinalis

2.2.3 染色溫度對染色效果的影響 由圖7可知,上染率隨著染色溫度的升高呈上升趨勢。在80～95 ℃溫度范圍內(nèi),染色效果隨著溫度提高而穩(wěn)定提高,但增幅有所減小,95 ℃時(shí)達(dá)到最大值,在100 ℃時(shí)有小幅下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因,可能是低溫時(shí)葉綠素銅鈉鹽的擴(kuò)散和結(jié)合比較慢,導(dǎo)致厚樸葉染色效率低,而高溫條件下綠素銅鈉鹽熱穩(wěn)定性下降,綠素銅鈉鹽又會(huì)發(fā)生降解。因此選取染色溫度90、95和100 ℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖7 染色溫度對脫色厚樸葉染色效果的影響Fig.7 Effect of temperature on leaves dyeing of Magnolia officinalis

2.2.4 染色時(shí)間對染色效果的影響 由圖8看出,染色效果隨染色時(shí)間的延長而穩(wěn)步增大,在10～40 min內(nèi)染色效果增加較快,超過60 min增幅逐漸減少,60～80 min時(shí)上染率沒有太大變化,說明染料在厚樸葉上的吸附量已經(jīng)接近飽和。選取時(shí)間20、40和60 min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖8 染色時(shí)間對脫色厚樸葉染色效果的影響Fig.8 Effect of time on leaves dyeing of Magnolia officinalis

2.2.5 染色正交實(shí)驗(yàn) 由表4顯示,影響厚樸葉染色的各因素作用主次順序是:料液比>葉綠素銅鈉鹽濃度>染色溫度>染色時(shí)間。厚樸葉染色的最佳條件是A1B1C2D2,即染液濃度4 g/L、料液比1∶5 g/mL、染色溫度95 ℃、染色時(shí)間40 min,厚樸葉復(fù)染呈亮綠色。說明用葉綠素銅鈉鹽對高含纖維素的厚樸葉染色是合適的[14]。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,該條件下的上染率達(dá)到25.3%±1.1%。

表4 厚樸葉染色研究正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal design results of dyeing

3 結(jié)論

通過單因素分析和正交實(shí)驗(yàn)研究最佳脫色條件,影響厚樸葉脫色效果的各因素作用以次為:料液比>乙醇濃度>脫色溫度>脫色時(shí)間,料液比和乙醇濃度對脫除厚樸葉中葉綠素的影響達(dá)到顯著水平,而脫色溫度和時(shí)間影響較小。最佳脫色條件為:乙醇濃度80%、料液比1∶50 g/mL、脫色溫度70 ℃、脫色時(shí)間3 h。葉綠素脫除效果較好,使厚樸葉轉(zhuǎn)變?yōu)榧儍舻牟杌ㄉ?/p>

按照最佳脫色條件脫色的厚樸葉,再用穩(wěn)定性好的葉綠素銅鈉鹽對其進(jìn)行復(fù)染呈亮綠色,提高了厚樸葉產(chǎn)品對光熱的穩(wěn)定性和商業(yè)價(jià)值。厚樸葉染色的最佳條件為:染液濃度4 g/L、料液比1∶5 g/mL、染色溫度95 ℃、染色時(shí)間40 min。說明利用葉綠素銅鈉鹽可以對高含纖維素的厚樸葉進(jìn)行復(fù)染。

在最佳工藝條件下,得到的厚樸葉呈現(xiàn)著色均勻一致的亮綠色,可以滿足特定消費(fèi)者對綠色厚樸葉產(chǎn)品的偏好。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討返綠厚樸葉作為包裝材料的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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