響應面法優化蠶豆多酚 超聲輔助提取工藝

錢 敏,李春陽,*,劉玉皎,王 帆,陳 新,吳 寒

(1.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014;3.青海省農林科學院,青海西寧 810000;4.江蘇省農業科學院經濟作物研究所,江蘇南京 210014)

蠶豆在我國已有二千年栽培史[1],是我國目前種植面積和產量位居第三的食用豆類作物,僅次于大豆和花生[2],分別占世界蠶豆種植面積和總產量的53.8%和64.1%[3]。中醫認為蠶豆的花、果實、種殼,及葉均可入藥,有止血,利尿解毒,消腫之功效,并且國外已有用蠶豆提取抗癌物質的報道[4]。有研究證明蠶豆中含有豐富的酚類化合物,具有降低小鼠心血管疾病的風險,可作為很好的天然抗氧化食物和功能食物的來源[5]。

目前,國內對豆類酚類物質研究較多,主要是比較不同品種豆類多酚含量及其抗氧化活性[6-8],李思荻等[7]研究發現,合豐大豆和白蕓豆對羥基自由基的清除能力強于其他豆類,提取液中的多酚含量與其抗氧化性成正相關關系。國外對于蠶豆多酚的研究主要集中在其抗氧化活性[9-11]及酚類物質組成成分分析[12-14],Marathe等[9]研究表明,表皮顏色較深的雜豆抗氧化性較強,且抗氧化性強弱與豆中所含酚類物質有關,Journi等[12]從蠶豆多酚中鑒定出槲皮素糖苷、表兒茶素糖苷等五種成分,Merghem等[13]利用電子噴霧質譜及高效液相色譜技術從蠶豆原花青素中分離鑒定出原花青素二聚物B1、B2和B3及原花青素三聚物等六種主要化合物。

由于超聲提取具有操作簡單方便、提取率高、提取溫度低、不破環提取物結構等特點,已廣泛用于提取天然植物有效成分,如橙皮多酚的提取[15]、海棠葉中總黃酮的提取[16]、茶多酚的提取[17]、獼猴桃根熊果酸的提取[18]、大豆異黃酮的提取[19]等。目前有關蠶豆多酚的提取主要還是溶劑浸提法,關于超聲波輔助提取蠶豆多酚工藝優化的報道尚不多見。因此本文將系統優化蠶豆多酚超聲提取工藝,并在已有報道的基礎上考慮了提取液的pH對多酚提取量的影響,以期獲得適宜的提取方法,為將來工業化高效提取蠶豆中酚類物質提供參考,以便進行蠶豆的保健品開發和蠶豆抗氧化劑制品的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇蠶三號 由江蘇省農業科學院蔬菜所提供;甲醇、乙醇、丙酮、無水碳酸鈉 均為國產分析純;沒食子酸標準品與Folin-Ciocalteu試劑 購自Sigma公司。

AL104型電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Sigma 3K15離心機 德國Sigma公司;RE-5203旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;萬能高速粉碎機 歐凱萊芙(香港)寶業公司;PHS-2C型數顯pH計 上海智光儀器儀表公司;752S型紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的制作 配制濃度為1 mg/mL的沒食子酸標準溶液,分別吸取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、10.00 mL于100 mL容量瓶中定容,得10、20、30、40、50、100 μg/mL的沒食子酸標準溶液,移取1 mL沒食子酸標準溶液于試管中,加入5 mL蒸餾水,1 mL 10%福林酚,反應3 min后加3 mL 7.5% Na2CO3,室溫下放置2 h,于765 nm處測吸光值[20]。以濃度(X)對吸光度(Y)進行線性回歸分析,繪制出沒食子酸標準曲線。

求得回歸方程為Y=0.0088X+0.0558(0～100 μg/mL,R2=0.9996),其中X為沒食子酸濃度,單位為μg/mL,Y為吸光度。

1.2.2 蠶豆多酚的提取及含量測定 將蠶豆冷凍干燥(-20 ℃預凍6 h,-80 ℃冷凍20 h,放入凍干機中,在冷阱溫度為-45 ℃,真空度為13.3 Pa、加熱隔板溫度為30 ℃左右冷凍干燥24 h),用萬能粉碎機將蠶豆粉碎,過60目篩,制得蠶豆粉(水分含量2.98%±0.06%,w/w),-20 ℃保存備用。準確稱取1 g蠶豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)加入60%乙醇溶液進行超聲提取,超聲功率300 W,超聲溫度35 ℃,提取20 min后4500 r/min離心10 min,收集上清液,殘渣用同樣的方法再次提取,合并兩次上清液,45 ℃減壓旋轉蒸干,甲醇定容至10 mL,-20 ℃避光儲存,用于多酚含量的測定。多酚提取量以每克提取物(干基)中所含相當于沒食子酸的量mg表示。

式中:C為測量液總酚濃度(μg/mL);V為提取液的總體積(mL);N為稀釋倍數;M為樣品除去水分質量(g);1000為質量轉化單位(mg/μg)。

1.2.3 提取劑種類的選擇 準確稱取1 g蠶豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)的比例分別加入體積分數均為60%的甲醇、乙醇、丙酮,用1 mol/L HCl調節至pH4(下文同),在300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究不同提取劑種類對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 乙醇體積分數對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉,按料液比1∶15 (g/mL)分別加入pH4,不同濃度的乙醇水溶液(20%、40%、60%、80%、100%),300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究乙醇體積分數對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4.2 料液比對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉,分別加入10、15、20、25、30 mL體積分數為60%、pH4的乙醇水溶液,300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究料液比對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4.3 提取時間對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉5份,分別加入15 mL體積分數為60%、pH4的乙醇溶液。300 W、35 ℃下超聲提取10、15、20、25、30 min,提取兩次,研究提取時間對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.4.4 提取液pH對提取效果的影響 準確稱取1 g蠶豆粉,分別加入15 mL體積分數為60%不同pH3、4、5、6、7、8、9的乙醇溶液,300 W、35 ℃下超聲提取20 min,提取兩次,研究pH對蠶豆多酚提取效果的影響。

1.2.5 響應面實驗設計 根據Box-Benhnken中心組合設計原則,以乙醇體積分數、料液比、提取時間、pH四個因素為自變量,多酚提取量為響應值,設計了四因素三水平的響應面分析實驗,各因素水平見表1。

表1 Box-Benhnken響應面實驗因子與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,實驗數據以平均值±標準差(Means±SD)表示,采用Excel 2003軟件作圖,使用SAS 9.3 軟件對數據結果進行處理分析,設置顯著水平為p<0.05,極顯著水平為p<0.01。中心組合實驗數據處理使用Design Expert 8.0.6軟件進行。

2 結果與分析

2.1 提取劑種類對提取效果的影響

從圖1可以看出,60%不同提取劑的提取效果依次為:乙醇>甲醇>丙酮,且乙醇的成本較低、環境友好,所以本文選擇乙醇作為提取溶劑。在楊希鵑等[21]的蠶豆多酚提取實驗中,60%甲醇的提取率高于60%乙醇,這可能是因為不同品種蠶豆中的酚類物質組成不同,導致極性不同,對甲醇和乙醇的親和性不同,從而導致最佳提取溶劑種類有差異。

圖1 提取劑種類對多酚提取量的影響Fig.1 The influence of the type of extracting solution on extraction volume

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 乙醇體積分數對提取效果的影響 由圖2可以看出,隨著乙醇濃度增大,多酚提取量呈現先增加后降低的趨勢,當乙醇濃度達到40%時,提取量最大。分析原因可能是蠶豆中多酚與多糖、蛋白質等以氫鍵和疏水鍵形成穩定的化合物,隨著乙醇濃度升高,對氫鍵斷裂作用越強,多酚提取量升高[22]。然而,當乙醇濃度超過40%時,多酚提取量下降,根據相似相溶原理推測可能是由于溶劑與多酚極性差異增大,多酚類物質得不到充分溶解,提取量反而下降。本文中多酚提取量隨乙醇體積分數的變化趨勢與王文昕等[23]的響應面法優化花生紅衣多酚提取的報道是相符的。因此本文選擇乙醇體積分數為40%。

圖2 乙醇體積分數對多酚提取量的影響Fig.2 The influence of the concentration of the extracting solution on extraction volume

2.2.2 料液比對提取效果的影響 由圖3可以看出,當料液比小于1∶25 (g/mL)時,隨料液比增大,蠶豆多酚提取量增大,這可能是因為,蠶豆組織中多酚與蛋白質、生物堿、多糖等以氫鍵等形式結合在一起,阻礙多酚類物質的提取,而有機溶劑和水的混合液能有效的抑制這種結合,因此提取液增大有利于蠶豆多酚的提取。但當料液比達到1∶25 (g/mL)以后,再增大溶劑的用量,多酚提取量下降,而且溶劑用量太大,會使熱負荷增大,提取完全所需要的時間增大[24]。在郭彩霞等[25]的響應面優化超聲波輔助提取獼猴桃果皮多酚實驗中也觀察到類似現象。因此本文選擇的料液比為1∶25 (g/mL)。

圖3 料液比對提取量的影響Fig.3 The influence of the solid-liquid ratio on extraction volume

2.2.3 提取時間對提取效果的影響 由圖4可以看出,當提取時間從5 min增加到20 min時,多酚提取量由1.31 mg/g d.w.增加至1.74 mg/g d.w.。這可能是因為超聲波提取能加速介質質點運動,同時產生空化作用,使提取物質加速浸出[26],當超聲時間大于20 min時,多酚提取量呈下降趨勢,這可能與超聲的時間過長,產生熱效應使溫度升高,從而使得多酚類物質結構被破環有關[27]。在Yang等[28]的響應面法優化余甘子樹皮多酚及Sun等[29]的響應面法優化苦丁茶中酚類物質提取的實驗中也觀察到類似現象。因此,選擇超聲提取時間為20 min。

圖4 提取時間對多酚提取量的影響Fig.4 The influence of the extracting time on extraction volume

2.2.4 提取液pH對提取效果的影響 由圖5可以看出,不同的pH對提取效果有顯著的影響,當pH為5時,多酚提取量最大。這可能是由于在酸性條件下多酚與酸形成佯鹽,以離子形式存在,容易析出;而且在酸性條件下多酚氧化酶的活性受到抑制,從而抑制了多酚在提取過程中的酶促氧化,進而提高了多酚的提取率。與趙謀明等[30]報道的多酚提取量隨pH變化趨勢相符。因此本文選擇pH5為適宜pH。

圖5 提取液pH對多酚提取量的影響Fig.5 The influence of the pH on extraction volume

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 二次響應面回歸模型的建立與分析 響應面設計與結果見表2。應用Design Expert 進行回歸擬合分析,得到提取條件與多酚提取量之間的二次多項式模型為:

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results

Y=2.17-(9.167E-003)A-0.028B+0.064C-0.026D-0.057AB-0.053AC-0.057AD-0.013BC+(2.500E-003)BD+0.047CD-0.13A2-0.19B2-0.22C2-0.20D2。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 3 Test of significance for regression equation coefficients

2.3.2 兩因子間交互作用分析 響應面分析圖見圖6～圖11。

由圖6可知,當料液比一定時,隨著乙醇體積分數的增大,提取量先增大后減小;當乙醇體積分數一定時,隨料液比的變化,提取量也呈先增大后減小趨勢,且響應面坡度較陡峭,說明乙醇體積分數和料液比的交互作用極顯著。

圖6 乙醇體積分數和料液比及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and solid-liquid ratio

圖7表示pH為5、料液比為1∶25 (g/mL)時乙醇體積分數和時間對蠶豆多酚提取量的影響。當時間一定時,隨乙醇體積分數變化,多酚提取量變化不明顯,趨勢較平緩;當乙醇體積分數一定時,隨時間變化,提取量先增后減,且弧度較陡,說明時間的主效應大于乙醇體積分數。

圖7 乙醇體積分數和時間及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and extracting time

圖8表示當料液比為1∶25 (g/mL)、提取時間為20 min時,乙醇體積分數和pH對蠶豆多酚提取量的影響。當pH一定時,隨乙醇體積分數的變化,提取量先增后減,趨勢較平緩;當乙醇體積分數一定時,隨pH變化,提取量先增大后減小,幅度較陡峭,說明pH的主效應大于乙醇體積分數,又等高線圖呈橢圓形,說明兩者間交互作用顯著。

圖8 乙醇體積分數和pH及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for extraction volume under the concentration of the extracting solution and pH

圖9表示當乙醇體積分數為45%、pH為5時,料液比和時間對蠶豆多酚提取量的影響。當時間一定時,隨料液比的增大,蠶豆提取量先增大后減小;當料液比一定時,隨時間變化,料液比先增后減。由等高線為圓形,可知兩者交互作用不顯著。

圖9 料液比和時間及其相互作用對蠶豆多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for extraction volume under solid-liquid ratio and extracting time

圖10表示乙醇體積分數為45%、提取時間為20 min時,料液比和pH對蠶豆多酚提取量的影響。當pH一定時,隨料液比升高,提取量先增后減;當料液比一定時,隨pH變化,提取量先升高后降低。由其等高線呈圓形,可知兩者交互作用不顯著。

圖10 料液比和pH及其相互作用 對蠶豆多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for extraction volume under solid-liquid ratio and pH

圖11表示乙醇體積分數為45%、料液比為1∶25 (g/mL)時,時間和pH對蠶豆多酚提取量的影響。當pH一定時,隨時間升高,提取量先增后減;當時間一定時,隨pH變化,提取量先升高后降低。

圖11 時間和pH及其相互作用 對蠶豆多酚提取量影響的響應面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots for extraction volume under extracting time and pH

2.3.3 最佳條件的預測及驗證實驗 通過響應面優化得到超聲波提取蠶豆多酚的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數44.71%、料液比1∶23.89 (g/mL)、時間20.09 min、pH4.8,此時蠶豆多酚提取量達到最大值(2.06±0.23) mg/g d.w.。為方便實際操作,各條件調整為:乙醇體積分數45%、料液比1∶25 (g/mL)、時間20 min、pH5,在此條件下進行驗證,測得蠶豆多酚提取量為(2.03±0.16) mg/g d.w.,與預測值(2.06±0.23) mg/g d.w.誤差值為1%,證實了該模型的有效性。本實驗多酚提取量與楊希鵑等[21]在正交優化條件甲醇體積分數60%,料液比1∶15 (g∶mL),超聲波功率300 W 的條件下提取 20 min,得到的蠶豆多酚提取量47.78 mg/100 g d.w.相比較高,推測可能是因為本實驗考慮了提取溶劑的pH,有機酸的添加促進了結合酚的釋放,從而提高了總酚的含量;該值與鞏藹[8]報道的用60%乙醇溶液水浴浸提3 h得到的蠶豆多酚含量值0.25%相近,但與Siah[31]用70%丙酮提取得到的多酚提取量6.2～10.7 mg/g d.w.、趙艷等[6]用70%丙酮(丙酮∶水∶乙酸=70∶29.5∶0.5,V/V/V)在25 ℃下振蕩3 h得到的總酚提取量5.80～8.37 mg/g d.w.實驗值相比還是較低,結果的差異可能與蠶豆品種、生長環境、栽培條件以及實驗方法等的不同都有很大關系。

3 結論

本實驗采用單因素實驗及響應面Box-Benhnken實驗設計,對超聲輔助提取蠶豆多酚工藝進行優化,得到的最佳工藝條件為:乙醇體積分數45%、料液比1∶25 (g/mL)、提取時間20 min、pH5,在此條件下蠶豆多酚提取量為(2.03±0.16) mg/g d.w.,與預測值(2.06±0.23) mg/g d.w.高度相符,模型可靠。

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