葵花籽粕多肽酶解液的精制

孫 乾,張愛琴,李 芳,董 聰,孔令明,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆輕工職業技術學院,新疆烏魯木齊 830021)

向日葵,又名太陽花,菊科向日葵屬[1-2],葵花籽即為向日葵的果實,葵花籽粕則是葵花籽提油后的副產物。葵花籽粕營養物質豐富,其中含有40%左右的優質植物蛋白[3],氨基酸組成均衡,還含有鈣、磷、煙酸、類脂、還原糖及天然食用紅色素、糠醛等[4]。為了充分利用優質蛋白的資源,已有國內外眾多學者分別對林蛙[5]、大豆[6]、大米[7]、黑籽瓜[8]、銀杏[9]、紫菜[10]、芝麻[11]、竹筍[12]等動植物中蛋白及多肽資源做了深入的研究。目前,對于多肽的制備方法主要有酸法、堿法、微生物發酵法[13-16]、電法、人工嫁接法、基因表達法和酶解法[17-21]等,其中輔助酶解法的因素有超聲波、微波、酶的激活劑、酶的抑制劑和最適酶解條件等。

國外相關文獻報道,大豆多肽具有一定的抗氧化、抗癌、降血脂作用[22-24]。國內也有相關研究,許巖等[25]運用液相色譜質譜聯用對植物蛋白以及多肽進行研究,并擴大其在食品領域中的應用;趙文竹等[26]對食源性植物糖蛋白的提取、純化,并指出了未來的發展趨勢;鄭豐杰[27]等利用酶解法對多肽的制備優化,闡明了植物性蛋白多肽的可利用價值前景。

活性肽是指可抑制大分子過氧化功能并具有清除自由基作用的多肽。分子的供氫能力和分子自身結構穩定性都直接或間接影響著抗氧化肽的抗氧化活性。在葵花籽粕的優質蛋白中,含有較多量的優良活性肽物質,但在實際生產中,大部分的葵花籽粕或被當做制作飼料的填充物,或被直接填埋,這不僅浪費了這種優良的多肽類物質,也造成了生態環境的污染。如何將葵花籽粕利用起來,成為待解決的關鍵問題。因此,本文通過相關性實驗,對榨油后的葵花籽粕進行一定的酶解,并確定葵花籽粕多肽酶解液的脫鹽及超濾工藝參數,為研發葵花籽粕相關產品的開發提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花籽粕 新疆莊子實業有限公司昌葵一號;D301-G型陰離子交換樹脂、732型陽離子交換樹脂 上海楊浦化工有限公司;微孔濾膜 上海密粒膜分離技術有限公司;超濾膜 上海摩速科學器材有限公司。氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇、石油醚、30%過氧化氫、乙酸鎂、考馬斯亮藍等試劑 均為分析純。

AL204-1C型分析天平 上海梅特勒托利多儀器有限公司;1200-30高溫爐 上海均珂儀器科技有限公司;DHG-9140A電熱鼓風干燥箱、ZK-100B型萬能粉碎機 上海一恒科學儀器有限公司;PC-400D電熱板 上海麥尚科學儀器有限公司;超濾裝置 Millipore公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;RF-02型旋轉蒸發器儀 上海青浦瀘西儀器廠;DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋、4-10型箱式電阻爐 北京市永光明醫療儀器有限公司;雷磁PHS-3C型 pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;TD5A-WS型臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 葵花籽粕蛋白提取工藝:葵花籽粕→粉碎→過80目篩→脫脂和綠原酸→懸浮液→調pH9.0→離心取上清液(4500 r/min,15 min)→收集上清液調pH4.0～4.5→離心取沉淀(4500 r/min,15 min)→真空冷凍干燥后待用[28]。

葵花籽粕蛋白酶解工藝:葵花籽粕蛋白→粉碎→過80目篩→懸浮液(2%,w/v)→調pH7.0～7.5→微波預處理(微波功率500 W、微波時間3 min、微波溫度55 ℃)→酶解(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為2∶1、酶底比2%、底物濃度2%、pH7.5、溫度50 ℃、酶解時間3 h)→90 ℃滅酶10 min→離心(4500 r/min,20 min)→取上清液[29]。

對葵花籽粕蛋白進行微波酶解處理后,將酶解后得到的抗氧化活性多肽酶解液作為脫鹽和超濾的樣品。

1.2.2 葵花籽粕多肽灰分的測定 參照GB 5009.4-2016食品安全國家標準 食品中灰分的測定[30]。

1.2.3 葵花籽粕多肽脫鹽率的測定 如式(1)。

式(1)

式中:Ma為脫鹽前灰分含量(mg);Mb為脫鹽后灰分含量(mg)。

1.2.4 測定滲透通量 如式(2)。

式(2)

式中:V為透過液的體積量(L);Sm為膜有效面積(m2=0.0116);t為超濾時間(h)。

1.2.5 測定膜污染度 如式(3)。

式(3)

式中:Ji為膜使用前的純水滲透通量;Jw為膜使用后的純水滲透通量。

1.2.6 葵花籽粕多肽抗氧化能力的測定

式(4)

1.2.6.2 ·OH的清除能力 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法并做一定的修改[32]。①稱量0.8 mmol/L 的鄰二氮菲溶液1 mL加入試管中,加入蒸餾水1 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)2 mL和0.8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL,混勻后再緩慢加入0.1%的H2O21 mL,置于37 ℃下恒溫1 h左右,測定其在536 nm處的吸光度為A1;②步驟同①,把0.1%的H2O21 mL用蒸餾水1 mL代替,測定其在536 nm處的吸光度為A2;③步驟同①,把蒸餾水1 mL用待測溶液1 mL代替,測定其在536 nm處的吸光度為A3。·OH清除率按照以下公式計算:

式(5)

1.3 葵花籽粕多肽脫鹽單因素實驗

1.3.1 樹脂的預處理方法 陰陽離子使用前的處理方法:取2 g吸附樹脂→加入2倍體積飽和的NaCl溶液(浸泡24 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至無顏色。

陽離子交換樹脂→加入2倍體積4%的NaOH溶液(浸泡4～8 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→再加入2倍體積5%的HCl(浸泡8～12 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→干燥備用。

陰離子交換樹脂→加入2倍體積5%的HCl(浸泡8～12 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→加入2倍體積4%的NaOH(浸泡4～8 h)→倒掉浸泡液體→蒸餾水漂洗至中性→干燥備用。

方才那一下，讓青辰真切體會到了什么叫“一力降十會”。與巖鷹力量上的差距，讓自己天葬刀的招式根本無法發揮出來，對方若是拼著命和自己死磕，必然會落得個兩敗俱傷、魚死網破的下場，只可惜自己并不想和一只鷹同歸于盡。

1.3.2 單因素實驗 依據張宇昊等[33-34]的研究,本實驗使用陰陽離子混合床脫鹽法。在陰陽離子交換樹脂比例為3∶2、過柱速度為8倍柱/h的條件下,選取不同的酶解液pH:3.5、4.5、5.5、6.5、7.5;在酶解液pH為4.5、過柱速度為8倍柱/h的條件下,選取不同的陰陽離子交換樹脂比例:1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2;在酶解液pH為4.5、陰陽離子交換樹脂比例為3∶2的條件下,選取不同的過柱速度:2、5、8、10和15倍柱/h。以抗氧化性和脫鹽率為指標,確定最適的酶解液精制pH、陰陽離子樹脂比和過柱速度。

1.4 葵花籽粕多肽超濾分離單因素實驗

對脫鹽所得葵花籽粕多肽酶解液在常溫條件下,使用截留分子量3 kDa的超濾膜進行超濾。在液體流速2 mL/s、超濾時間60 min的條件下,選取0.05、0.1、0.15、0.2和0.25 MPa不同的壓力;在超濾壓力0.16 MPa、超濾時間60 min的條件下,選取0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL/s不同的液體流速;在超濾壓力0.16 MPa、液體流速為2.5 mL/s的條件下,選取5、10、30、60、120、240和300 min不同的超濾時間。以滲透通量和膜污染度為指標,確定最適的超濾壓力、流速和時間。

1.5 數據處理及分析

采用Oringin 8.5結合SPSS 18.0軟件作圖,并對所得數據進行對比性分析。

2 結果與分析

2.1 葵花籽粕多肽脫鹽單因素實驗的結果與分析

2.1.1 酶解液pH對脫鹽效果的影響 pH的變化對脫鹽效果的影響如圖1所示。

圖1 改變酶解液pH對脫鹽效果的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis liquid pH on desalination注：圖中不同英文字母表示差異顯著(p<0.05)；圖2、圖3同。

2.1.2 改變陰陽離子交換樹脂比例對脫鹽效果的影響 陰陽離子交換比例的變化對脫鹽效果的影響結果見圖2。

圖2 改變陰陽離子交換樹脂比例對脫鹽效果的影響Fig.2 Effect of changing the proportion of anion and anion exchange resin on desalination effect

2.1.3 改變過柱速度對脫鹽效果的影響 改變過柱速度對脫鹽效果的影響結果見圖3。

圖3 改變過柱速度對脫鹽效果的影響Fig.3 Effect of changing column velocity on desalting efficiency

2.2 葵花籽粕多肽超濾分離單因素實驗的結果與分析

Yen G C等[35]的研究表明,抗氧化肽多為分子量小于1或1左右的短肽。分別選用3、5、10 kDa的超濾膜對脫鹽后的葵花籽粕多肽酶解液進行超濾分析,結果如表1所示。

表1 葵花籽粕多肽酶解液在不同處理下的抗氧化能力Table.1 Antioxidant capacity of sunflower seed cake hydrolyzate under different treatments

由表1可知,隨著截留分子量的增大,葵花籽粕多肽酶解液的抗氧化能力逐漸減小,從側面說明了小分子肽段的抗氧化能力要相對較強一些。因此選擇葵花籽粕多肽酶解液的超濾膜為3。

2.2.1 超濾壓力對超濾效果的影響 超濾壓力對超濾的影響結果見圖4。

圖4 滲透通量和膜污染度受超濾壓力變化的影響Fig.4 Permeate flux and membrane fouling are affected by changes in ultrafiltration pressure

由圖4可得,在0.04～0.16 MPa的范圍內,隨著超濾壓力的增大,滲透通量逐漸增大,膜污染度逐漸減小。當壓力在0.16 MPa繼續增大時,滲透通量轉為減小,膜污染度增大。這有可能是因為初期的壓力,未使大分子物質在膜表面停留;后期的壓力,使大分子物質在膜表面聚集量迅速增大,導致滲透通量降低,膜過度被污染。因此選定超濾壓力為0.16 MPa。

2.2.2 液體流速對超濾效果的影響 液體流速對超濾的影響結果見圖5。

圖5 滲透通量和膜污染度受液體流速變化的影響Fig.5 Permeate flux and membrane fouling are affected by changes in velocity of flow rate

由圖5曲線趨勢可以得出,在一定指標范圍內,隨著液體流速的增大,滲透通量逐漸增大,膜污染度則呈現出先降低后升高的趨勢。當多肽酶解液流速在2.5 mL/s時,膜污染度迅速增大。這有可能是因為流速增大,導致膜面凝膠層與流動邊界層的厚度降低。因此選定液體流速為2.5 mL/s。

2.2.3 超濾時間對超濾效果的影響 水與溶質向溶液主體擴散,滲透通量急劇下降,這種濃差極化現象會嚴重影響超濾時的效果。超濾時間對超濾的影響結果見圖6。

圖6 滲透通量和膜污染度受超濾時間變化的影響Fig.6 Permeate flux and membrane fouling are affected by changes in ultrafiltration time

由圖6曲線趨勢可以得出,在一定指標范圍內,隨著超濾時間的延長,滲透通量逐漸降低,膜污染度逐漸增大。大分子物質隨著時間的增長,在膜表面不斷聚集堵塞,導致滲透通量下降、膜污染度升高。當超濾時間在60 min時,滲透通量已經下降了45.73%,此時的膜污染度處于一個相對平穩期,由較高的膜污染度降到較低的程度,而也正是在60 min時,膜的滲透通量呈現出逐漸增大的趨勢,因此選定超濾時間為60 min。

在超濾壓力為0.16 MPa、液體流速為2.5 mL/s、超濾時間為60 min的條件下,有最大的滲透通量為25.98 L/m2·h和最小的膜污染度為0.021。

3 討論與結論

通過單因素實驗可知,采用陰陽離子混合床法對葵花籽粕多肽酶解液進行脫鹽處理,酶解液pH的高低、陰陽離子交換樹脂的比例和過柱速度快慢都直接影響到酶脫鹽率及抗氧化性,雖然使用此方法抗氧化性在一定程度上有所降低,但脫鹽率有很大提高。根據實驗的相關數據表明,使用3 kDa的超濾膜進行多肽的過濾是一種較為理想的方法,這一定程度上是因為多肽的抗氧化能力跟隨分子量的變化而產生相應的變化,分子量小反而抗氧化能力較強,說明了小分子的肽段更具有較強的抗氧化性。但隨時間推移,過多的大分子物質在膜孔壁聚集,致使滲透通量下降、膜污染度升高。同理,前期的壓力大、流速快,膜滲透通量較大,相應的膜污染度亦較小;后期的壓力較大、流速較快,致使膜前大分子物質迅速聚集,造成膜滲透通量降低、膜污染度較高。

[1]董聰,李芳,王琳,等. 雙酶酶解葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究[J]. 食品工業科技,2015,36(11):116-121.

[2]柳延濤,陳寅初,李萬云,等. 向日葵產業技術體系需求調研報告[J]. 新疆農墾科技,2012,35(10):3-6.

[3]陳大淦,倪培德. 植物蛋白的加工和利用[M]. 北京:中國食品出版社,1998.

[4]陳少洲. 油葵中綠原酸和咖啡酸的提取及對oxLDL誘導損傷內皮細胞的保護作用[D]. 北京:中國農業大學,2003.

[5]李蘭洲,張爽,王娟,等. 林蛙抗菌肽的制備及抑菌活性研究[J]. 食品安全質量檢測學報,2015,6(3):1067-1072.

[6]Rayaprolu S,Hettiarachchy N,Horax R,et al. Amino acid profiles of 44 Soybean lines and ACE-I inhibitory activities of peptide fractions from selected lines[J]. Journal of the American Oil Chemists Society,2015,92(7):1-11.

[7]朱恩俊,華從伶,安莉. 大米多肽功能性質及制備方法的研究進展[J]. 食品與機械,2010,26(4):142-145.

[8]陸曉婷,張超,張暉,等. 黑籽瓜種子蛋白酶解工藝及抗氧化性研究[J]. 食品科技,2015,40(5):73-78.

[9]賈韶千,吳彩娥,范龔健,等. 銀杏抗氧化肽的分離純化及活性鑒定[J]. 農業機械學報,2011,42(6):152-155.

[10]王茵,蘇永昌,吳靖娜,等. 紫菜多肽降血脂及抗氧化作用的研究[J]. 食品工業科技,2013,34(16):334-337.

[11]邵元龍,董英. 芝麻蛋白水解工藝優化及芝麻多肽組分抗氧化活性的研究[J]. 中國糧油學報,2010,25(1):69-73.

[12]林倩. 竹筍短肽制備及其抗氧化活性研究[D]. 北京:中國農業科學院,2011.

[13]Hong K J,Lee C H,Kim S W. Aspergillus oryzae GB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meals[J]. Journal Medicinal Food,2004,7(4):430.

[14]Jane Hubert,Monique B,Francoise N,et al. Effects of fermentation on the phytochemical composition and antioxidant properties of soy germ[J]. Food Chemistry,2008,109(4):709-721.

[15]徐聰聰. 固態發酵豆粕制備大豆抗氧化活性肽的研究[D]. 廣州:暨南大學,2013.

[16]張樹華. 發酵法制備綠豆多肽[D]. 青島:齊魯工業大學,2014.

[17]洪愛俊,田雙起. 超聲波技術在農副產品中應用的研究

進展[J]. 寧夏農林科技,2011,52(2):71-72.

[18]Elias R J,Bridgewater J D,Vachet R W,et al. Antioxidant mechanisms of enzymatic hydrolysatesβ-lactoglobulin in food lipid dispersions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(25):9565-9572.

[19]Vinatoru M. An overview of the ultrasonically assisted extraction bioactive principles from herbs[J]. Ultrason Sonochemistry,2001,8(3):303.

[20]龔志華,梁丹,張志博,等. 微波輔助提取茶籽皂苷的研究[J]. 茶葉科學,2013,33(4):358-363.

[21]Zhou Y,Liu X. Study on the security of food processed by microwave technology[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing,2007,11(10):41-44.

[22]Burr J D,Wood J R,Smith A E,et al. Aerosolization device with improved endpiece connection:US,WO/2003/041777[P]. 2003.

[23]Lumen D,Ben O. Lunasin:A Cancer-Preventive Soy Peptide[J]. Nutrition Reviews,2005,63(1):16-21.

[24]Zhao C J,Schieber A,G?nzle M G. Formation of taste-active amino acids,amino acid derivatives and peptides in food fermentations-A review[J]. Food Research International,2016,89(Pt 1):39.

[25]許巖,任皓威,周廣運,等. 液相色譜質譜聯用技術在植物蛋白及多肽研究中的應用[J]. 食品工業科技,2017,38(17):310-318.

[26]趙文竹,張瑞雪,于志鵬,等. 食源性植物糖蛋白研究進展[J]. 食品工業科技,2016,37(16):389-395.

[27]鄭豐杰,高云,牟明峰,等. 雙酶水解制備植物蛋白活性多肽工藝優化[J]. 食品科學,2011,32(s2):200-202.

[28]Zhu X,Li Y,Fu H,et al. The influence of pre-treatment on sunflowerseed meal protein extraction rate and emulsibility[J]. Journal of Hetao College,2016.

[29]徐姍姍,阮美娟,李廣鵬. 葵花籽粕多肽的提取工藝研究[J]. 食品工業科技,2012,33(20):245-247.

[30]中華人民共和國衛生部. GB 5009.4-2016 食品中灰分的測定[S]. 北京:中國標準出版社,2016.

[31]趙濤. 葵花籽粕中綠原酸和蛋白酶解肽的制備及生物活性研究[D]. 呼和浩特:內蒙古農業大學,2013.

[32]Barry Halliwell,John M C,Aruoma. The deoxcyribose method:A simpletest-tube assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyi radials[J]. Analytical biochemistry,1987(165):215-219.

[33]張宇昊,馬良,謝祥,等. 花生短肽脫鹽工藝研究[J]. 中國糧油學報,2010,25(2):117-120.

[34]崔誠,陳悅,陳季旺,等. 基于混合床離子交換樹脂脫鹽的草魚肽及其理化性質[J]. 食品科學,2013,34(18):23-27.

[35]Yen G C,Chen H Y. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1995,43(1):27-32.