低溫等離子體殺菌工藝的優化及其 對梨汁品質和抗氧化活性的影響

于弘慧,馬挺軍,孫運金,陳璧州,李紅衛,*

(1.北京農學院食品科學與工程學院,北京 102206;2.農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河北水晶梨 北京市昌平區回龍觀西大街物美超市;大腸桿菌ATCC8099 中國工業微生物菌種保藏管理中心;胰蛋白胨、酵母浸提液、NaCl、瓊脂、營養瓊脂、抗壞血酸 北京奧博星生物技術有限責任公司;DPPH、沒食子酸標準品、Folin-Phenol 美國Sigma公司;碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、碳酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、草酸、水楊酸 均為國產分析純。

低溫等離子體反應器(北京農學院食品科學與工程學院自制,交流電輸出0～6 kV,電源頻率10 kHz);IKA MS2磁力攪拌器、JA1003電子分析天平 上海天平儀器廠;WFJ2100可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制造;MJ-25BM04B榨汁機 廣東美的精品電器制造有效公司;DHP-500電熱恒溫培養箱 天津市中環實驗電爐有限公司;MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌鍋 日本Panasonic公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梨汁制備 購買同一生產批次無病蟲害、無機械損傷、新鮮的水晶梨作為實驗原料。自來水沖洗后,去皮,切成塊,放入攪碎機中榨取濾液備用,做低溫等離子體殺菌實驗時,將鮮榨梨汁在120 ℃高溫下滅菌15 min,然后將大腸桿菌ATCC8099稀釋至1.01×108～1.01×109cfu/mL,接種到梨汁中。

1.2.2 殺菌處理 將接種大腸桿菌后的梨汁分為3組,第一組用50 mL 120 ℃高溫滅菌15 min的無菌小燒杯盛裝3 mL梨汁放在磁力攪拌器上以500 r/min在低溫等離子體反應器中進行殺菌,電源電壓0～5 kV,氣體流量40～80 L/min,常溫常壓,液體距離放電口3 cm;第二組取30 mL梨汁放入50 mL小燒杯中進行巴氏殺菌,90 ℃,10 min;第三組不進行殺菌處理,室溫放置相同時間。將不同條件處理后的梨汁稀釋到適當倍數(10-6～10-7),移取0.2 mL于LB培養基中,37 ℃恒溫培養24 h,采用GB 4789-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗標準》[23]中平板計數法對大腸桿菌進行計數。殺菌率以logN0/N表示,N0為表示殺菌前梨汁大腸桿菌活菌數,N表示殺菌后梨汁中大腸桿菌活菌數。

1.2.3 低溫等離子體殺菌單因素實驗 為了考察殺菌時間對殺菌率的影響,取3 mL接種后梨汁進行殺菌處理,控制電源電壓為4 kV,空氣流速為60 L/min,分別振蕩殺菌1、2、3、4、5 min;為了考察電源電壓對梨汁殺菌率的影響,取3 mL接種后梨汁進行殺菌處理,殺菌時間固定為4 min,空氣流速60 L/min,電源電壓分別為1、2、3、4、5 kV,為了考察空氣流速對梨汁殺菌率的影響,取3 mL接種后梨汁進行殺菌處理,控制殺菌時間為4 min,電壓控制在4 kV,空氣流速分別為40、50、60、70、80 L/min,每個處理做三個平行實驗。

1.2.4 低溫等離子體殺菌響應面設計 根據單因素實驗結果,以殺菌時間、空氣流速、電源電壓為工藝參數,設計三因素三水平Box-Behnken響應面實驗,以大腸桿菌為考察指標,共設計5個中心點和17組實驗,實驗因素水平設計如表1所示。

表1 響應面因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 殺菌前后梨汁品質的指標測定 選取最優低溫等離子體殺菌工藝條件與巴氏殺菌品質指標做比較。VC含量的測定:采用國標法[24],測定標準曲線為y=0.1458x-0.1412R2=0.9899;總酚含量的測定:采用福林酚法,以沒食子酸計算,測定標準曲線為y=0.5985x+0.0047R2=0.9834;總酸的測定:采用酸堿滴定法,以蘋果酸計算;還原糖的測定:采用直接滴定法,以葡萄糖計算;可溶性固形物含量的測定:使用手持糖度儀測定[25-26];色澤:采用色差儀進行測定。

1.2.6 殺菌前后梨汁DPPH自由基的清除率 在干凈小燒杯中加入2 mL鮮榨梨汁、DPPH自由基溶液(0.2 mmol/L),振蕩混合后避光靜置30 min,在517 nm波長下測定吸光度A1,并做三次平行實驗,計算公式如下:

式中:A1為梨汁的吸光度;A2為梨汁與無水乙醇溶液混合吸光度;A3為乙醇與DPPH溶液混合測吸光度[27-28]。

1.2.7 殺菌前后梨汁羥自由基清除能力測定 在干凈的小燒杯中加入2 mL的 梨汁、FeSO4(10 mmol/L)、水楊酸-乙醇溶液(10 mmol/L)和 H202(6 mmol/L),充分混勻,避光放置10 min后于510 nm波長處測定吸光度A1。以VC作對照測吸光度為A2,蒸餾水做空白測吸光度為A3,并做三次平行實驗,計算公式如下：

式中:A1為梨汁的吸光度;A2為VC的吸光度;A3為蒸餾水的吸光度[27-28]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

殺菌時間對殺菌率影響見圖1A,大腸桿菌的殺菌率隨著殺菌時間的增加而增加,在殺菌4 min時達到最大值,殺菌5 min時,殺菌率基本維持不變,這是因為在較短時間所釋放的等離子體活性成分較少,對大腸桿菌殺菌作用力低,所以殺菌率低,而達到一定時間后,等離子體釋放量不斷增加,大部分大腸桿菌被殺滅,再增加時間殺菌率也沒有很大的提高。最優殺菌時間為3～5 min[29]。

圖1 殺菌時間(A)、電壓(B)、空氣流速(C) 對梨汁殺菌效果的影響Fig.1 Effect of sterilizing time(A),voltage(B)，air flow rate(C)on sterilization of pear juice

電源電壓對殺菌率影響見圖1B所示,大腸桿菌的殺菌率同樣隨著電源電壓的增大而增大,當電壓達到3 kV時迅速增加,到4 kV時殺菌率上升相對緩慢,電壓升到5 kV時殺菌率變化較小,因為電壓可以控制等離子體的釋放量,當電壓升高時,等離子體也增加,當增加到一定量時就能夠將大腸桿菌殺滅。最適電壓為3～5 kV[30]。

空氣流速對殺菌率影響見圖1C,大腸桿菌殺菌率隨著空氣流速的加大而增加,其中當空氣流速達到70 L/min時,低溫等離子體對大腸桿菌殺滅效果趨于穩定,基本能夠將大部分大腸桿菌殺滅,由于等離子體是通過加壓的空氣來噴射到液體表面的,通過增加空氣流速,能夠使等離子體充分與液體接觸,而當空氣流速增加到一定量時,等離子體能夠與液體充分接觸進而殺菌,因此再增加流速其殺菌率變化不明顯。最適空氣流速為60～80 L/min。

2.2 響應面實驗設計與結果

通過單因素的實驗結果,利用響應面法對低溫等離子體殺菌工藝進行優化,以大腸桿菌殺菌率為響應值,進行三因素三水平Box-Behnken響應面優化實驗,17個實驗組設計與結果如下。

表2 Box-Behnken實驗設計與響應值Table 2 Experimental design and response value of Box-Behnken

以殺菌率為響應值,通過Design Expert軟件得出響應值與殺菌時間、電壓和空氣流速三個因素之間關系,對實驗數據進行二次多元回歸擬合,獲得響應值與變量之間的方程:Y=2.59+0.30A+0.71B+0.030C+0.34AB+0.005AC-0.010BC-0.20A2+0.075B2-0.20C2

由表3可知,該模型為極顯著模型(p<0.01),失擬項不顯著(p=0.4305),說明該模型與實驗擬合較好。R2=0.9563,因此95.63%的殺菌率可用該模型解釋,能夠較好的表達各個因素與殺菌率之間的關系。殺菌時間A、電壓B及其交互項AB對殺菌率的影響極顯著(p<0.01);空氣流速C、交互項AC與BC、二次項A2、B2、C2對殺菌率影響均不顯著(p>0.05)。去除不顯著因子后所得三因素之間的回歸方程為:

表3 響應面方差分析Table 3 Variance analysis of response surface

Y=2.59+0.30A+0.71B+0.030C+0.34AB

交互項AB的響應面及等高線圖如圖2所示。

圖2 殺菌時間與電源電壓響應面和等高線Fig.2 Responsive surfaces of sterilizing time and voltage and contour line

該圖為空氣流速一定即70 L/min時,殺菌時間與電源電壓交互作用對殺菌率的影響,由圖我們可以看出,殺菌率隨著電壓和殺菌時間的增加而增加,且電源電壓對殺菌率影響更為顯著。

2.3 擬合優化的驗證

通過擬合模型優化出最佳殺菌工藝條件為:殺菌時間5 min,電源電壓為5 kV,空氣流速為70.61 L/min,其殺菌率為3.81 logN0/N。利用該最優參數進行驗證,實驗重復3次,其分別為3.67、3.59、3.88 logN0/N,與模型預測值相符,在允許誤差范圍內,因此該模型可靠、有效。

2.4 巴氏殺菌對梨汁殺菌效果

原含有1.01×108～1.01×109cfu/mL大腸桿菌的梨汁,經過90 ℃,10 min巴氏殺菌后未有大腸桿菌檢出。

2.5 不同殺菌方式對梨汁殺菌效果及品質的影響

由表4可以看出,殺菌處理后,L值、總酸含量、還原糖和可溶性固形物變化不顯著(p>0.05)。而低溫等離子體殺菌與巴氏殺菌后的ΔE差異顯著(p<0.05),說明經過熱處理后梨汁顏色有顯著的變化,與Hartyani的研究結果一致[31]。總酚和VC含量的下降較為顯著(p<0.05),經過巴氏殺菌后,梨汁的總酚和VC的保留率分別為39.2%和38.2%,而經過低溫等離子殺菌處理,梨汁總酚和VC的保留率達到了65.7%和58.8%,分別高出巴氏殺菌26.5%和20.6%,這是由于巴氏殺菌的高溫作用使VC和酚類物質發生了分解等化學反應。

表4 不同殺菌方式對梨汁品質的影響Table 4 Effects of different sterilization methods on pear juice quality

2.6 不同殺菌方式對梨汁抗氧化能力的影響

由圖3可知,梨原汁的DPPH自由基清除能力達到了95.23%,清除羥自由基能力達到72.45%,殺菌處理后DPPH自由基和羥自由基清除能力均呈下降趨勢,其中低溫等離子體殺菌后DPPH的清除率為79.02%,羥自由基清除能力為66.23%,而巴氏殺菌對其影響較為嚴重,DPPH的清除率為61.89%,羥自由基清除清除率為52.92%。低溫等離子體殺菌與巴氏殺菌相比,前者對DPPH自由基和羥自由基的清除能力分別比后者高出17.99%和18.37%,可見前者對梨汁抗氧化能力的負面影響顯著低于后者。

圖3 不同殺菌方法對梨汁抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of different sterilization methods on the antioxidant capacity of pear juice

3 結論

低溫等離子體能夠快速、有效的殺滅梨汁中的大腸桿菌,當殺菌時間為5 min、電源電壓為5 kV、空氣流速為70 L/min時,其殺菌效果最佳,殺菌率為3.81 logN0/N。與巴氏殺菌對比,低溫等離子體殺菌能夠更好的維持梨汁原有的品質,尤其是對總酚和VC的影響明顯小于前者,此外,低溫等離子體殺菌會降低梨汁對DPPH自由基和羥自由基的清除能力,但其降幅明顯低于前者。可見,低溫等離子體殺菌是一種具有良好應用前景的非熱殺菌方式。

[1]呂永來. 2014年全國各省(區、市)水果產量完成情況分析[J]. 中國林業產業,2015,(12):24-27.

[2]李婭西,邵先軍,彭兆裕,等.介質阻擋放電對橙汁滅菌及其品質的影響[J]. 高電壓技術,2012,1:211-216.

[3]Deng S R,Ruan C Y,Mok G,et al. Inactivation ofEscherichiacolion almonds using nonthermal plasma[J]. Journal of Food Science,2007,72(2):62-66.

[4]Perni S,Liu D W,Shama G,et al. Cold atmospheric plasma decontamination of the pericarps of fruit[J]. Journal of Food Protection,2008,71(2):302-308.

[5]Ma H B,Roger ruan,Lin X G,et al. Non-thermal pasteurization of liquid foods using non-thermal plasma[J]. Transactions of the CSAE,2002,18(5):155-159.

[6]LIn X G,Ruan R S,Zhu R B,et al. Study on an new non-thermal pasteurization technique for liquid foods[J]. Food Science,2006,27(1):57-61.

[7]馬挺軍,史喜成,賈昌喜. 低溫等離子體應用于食品殺菌的研究進展[J]. 食品科技,2007(12):26-28.

[8]趙會超. 低溫等離子體技術應用研究[D].南京:南京航空航天大學,2013.

[9]Moreira A J,Smansano R D,Pinto T J A,et al. Sterilization by oxygen Plasma[J]. Applied Surface Science,2004,235:151-155.

[10]Trompeter Franz-josef,Neff Willi J,Franken Oliver,et al. Reduction of bacillus subtilis and aspergillums niger spores using nonthermal atmospheric gas discharges[J]. IEEE Transactions on Plasma Science,2002,30(4):1416-1423.

[11]Moisan M,Barbeau J,Moreau S,et al. Low-temperature sterilization using gas plasmas:A review of the experiments and an analysis of the inactivation mechanisms[J]. International Journal of PH armaceutics,2001,160(1/2):75-81.

[12]Montie T C,Kelly Wintenberg K,Roth J R,et al. An overview of research using the one atmosphere uniform glow discharge plasma(OAUGDP)for sterilization of surfaces and materials[J]. IEEE Trans Plasma Sci,2000,28(1):41-50.

[13]Reece Roth J,Sherman Daniel M,Gadri Rami Ben,et al. A remote exposure reactor(RER)for plasma processing and sterilization by plasma active species at one atmosphere[J]. IEEE Transactions Plasma Sciences,2002,30(4):1416-1422.

[14]Mendis D A,Rosenberg M,Azam F. A note on the possible electrostatic disruption of bacteria[J]. IEEE Trans Plasma Sci,2000,28(4):1304-1306.

[15]Mounir Laroussi. Sterilization of contaminated matter with an atmospheric pressure plasma[J]. IEEE Transactions on Plasma Science,1996,24(3):1188-1191.

[16]Rami Ben Gadri,J Reece Roth,Thomas C Montie,et al. Sterilization and plasma processing of room temperature surfaces with a one atmosphere uniform glow discharge plasma(OAUGDP)[J]. Surface and Coarings Technology,2000,131(1):528-542.

[17]Kuzmichev A I,Soloshenko I A,Tsiolko V V,et al. Feature of sterilization by different type of atmospheric pressure discharges[J]. High Pressure Low Temperature Plasma Chemistry,2001,15(2):402-406.

[18]郭儉. 低溫等離子體殺菌機理與活性水殺菌作用研究[D]. 杭州:浙江大學,2016.

[19]Purevdorj D,Igura N,Hayakawa I,et al. Inactivation ofEscherichiacoliby microwave induced low temperature argon plasma treatments[J]. Journal of food Engineering,2002,53:341-346.

[20]Marsili L,Espie S,Anderson JG,et al. Plasma inactivation of food-related microorganisms in liquids[J]. Radiation Physics and Chemistry,2002,65:507-513.

[21]Critzer F J,Kelly-Wintenberg K,South S L,et al.Atmospheric plasma inactivation of foodborne pathogens on fresh produce surfaces[J]. J. Food Protect,2007,70(10):2290-2296.

[22]Danijela B,Kovac evic,Predrag P. Effects of cold atmospheric gas phase plasma on anthocyanins and color in pomegranate juice[J]. Food Chem,2015,190:317-323.

[23]國家標準化管理委員會. GB 4789-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗標準[S]. 北京:中國標準出版社,2010.

[24]任潔,吳志敏,張麗,等. 不同品牌的橙汁飲料中維生素c含量的測定[J]. 廣東化工,2010,37(5):232-233.

[25]國家標準化管理委員會. GB/T 5009-2003食品檢驗方法:理化檢驗[S]. 北京:中國標準出版社,2003.

[26]曹建康,姜微波,趙玉梅. 果蔬采后生理生化實驗指導[M]. 北京:中國輕工業出版社,2007.

[27]Truong V D,Hu Z,Thompson R L,et al. Pressurized liquid extraction and quantification of anthocyanins in purple-fleshed sweet potato genotypes[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2012,26(1/2):96-103..

[28]熬純. 老鷹茶蟲釀茶營養成分及其提取物體外抗氧化作用研究[D]. 重慶:西南大學,2010.

[29]張錚.常壓空氣等離子體對液相環境中金黃色葡萄球菌的殺滅效果研究[J].中國消毒學雜志,2016,33(6):509-513.

[30]林向陽,李雁暉,黃彬紅,等.介質阻擋放電等離子體(DBDP)對橙汁殺菌及鈍化酶的影響[J].中國報,2010,10(6):14-21.

[31]Hartyani P,Dalmadi I,Knorr D. Electronic nose investigation ofAlicyclobacillusacidoterrestrisinoculated apple and orange juicetreated by high hydrostatic pressure[J]. Food Control,2013,32(1):262-269.