普魯蘭多糖/槐糖脂抑菌保鮮膜的制備

葛 晨,商夢潔,陶雙雙,李俊峰,梁生康,李紅芳,*

(1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院,山東青島 266042;2.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室,山東青島 266100)

傳統(tǒng)不可再生的塑料保鮮膜難以降解,可食用生物保鮮膜作為其替代品,逐漸成為保鮮領域的研究熱點[1]。可食用膜按來源可分為多糖類、蛋白質類、脂質類、復合型可食用膜等。一般而言,多糖類可食用膜較蛋白質類、脂質類更為穩(wěn)定,且阻水性和抗氧性好,可延長食品的貨架期,應用于保鮮領域[2]。多糖中,普魯蘭多糖較其他多糖粘度低,與塑料合成膜性質相似[3],同時可生物降解,作為成膜材料綠色環(huán)保。目前已有研究者制備出普魯蘭多糖-海藻酸鈉-羧甲基纖維素復合膜[4],普魯蘭多糖-殼聚糖復合膜[5]和普魯蘭多糖-明膠復合膜[6]。單獨使用普魯蘭多糖制作的薄膜脆而軟[7],卻能大大節(jié)約成本,簡化保鮮膜的生產工藝。加入甘油作為增塑劑[8],可增加膜的柔韌性,但會降低膜對水蒸汽和氣體的阻隔性能[9]。槐糖脂生物表面活性劑可一定程度彌補甘油的不足,在成膜過程中起關鍵作用。槐糖脂不僅具有食品保鮮[10]和抑菌功能[11],還具有清潔劑和乳化劑的功效[12],其作為成膜材料國內外鮮有報道。

本實驗以普魯蘭多糖、甘油、槐糖脂為原料制備抗菌保鮮膜,采用單因素實驗和正交實驗確定保鮮膜各方面性能最佳的配方,通過水果保鮮實驗,驗證保鮮膜在實際應用中的保鮮能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普魯蘭多糖 食品純,本實驗室發(fā)酵制備(以廢糖蜜為發(fā)酵原料);C18槐糖脂 生物純,本實驗室發(fā)酵制備(以廢糖蜜和煎炸廢油為發(fā)酵底物);甘油 分析純,天津市富宇精細化工有限公司;櫻桃 當天采摘的新鮮水果;大腸桿菌(EscherichiacoliTop10)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、白色假絲酵母菌(CandidaalbicansATCC 10321) 青島科技大學海洋科學與生物工程學院發(fā)酵實驗室保藏。

ME204E分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2102 PCS型紫外可見光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海驚宏實驗設備有限公司;NDJ-8S旋轉粘度計 上海平軒科學儀器有限公司;外經千分尺 無錫錫工量具有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 保鮮膜的制備 取一定量甘油、槐糖脂溶于25 mL水中,加入一定量普魯蘭多糖,加熱溶解并攪拌均勻,60 ℃超聲波(40 kHz,200 W)去氣泡30 min,然后在玻璃板上倒入一定量的膜液,涂抹均勻。由于成膜溫度對膜性能會產生影響[4],分別在40、60、80 ℃的溫度下處理2 h,冷卻至室溫后揭膜。

1.2.2 單因素實驗 以普魯蘭多糖、槐糖脂、甘油為基準進行實驗設計:槐糖脂為3.2 g/L,甘油為10 g/L,普魯蘭多糖濃度為8、12、16、20、24 g/L;普魯蘭多糖為16 g/L,甘油為10 g/L,槐糖脂濃度為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 g/L;普魯蘭多糖為16 g/L,槐糖脂為3.2 g/L,甘油濃度為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L;按照上述配方配制不同膜液,成膜后進行性能測定,確定適宜正交實驗水平。

1.2.3 厚度測定 從制成的完整膜上隨機選取5個2 cm×2 cm的膜,測其厚度。

1.2.4 透光率測定 將膜樣品貼于比色皿外,置于波長為600 nm的紫外可見光光度計中,測其透光率[6]。

1.2.5 水溶性測定 取裁剪成規(guī)格為2 cm×2 cm的膜樣品,室溫下攪拌溶解,記錄樣品溶解時間[6]。

1.2.6 透油性測定 將膜置于濾紙上,在膜不同位置滴的植物油,觀察并測量油滴在濾紙上擴散圈的直徑。

1.2.7 透水蒸汽性測定 按照GB 1037-88[13]中透水蒸汽性的測定方法,在試管底部裝入適量已經烘干至恒重的無水氯化鈣,控制內部恒定的濕度,將保鮮膜覆蓋于試管口,2 d后根據(jù)公式(1)計算透水蒸汽性。

式(1)

式中:A為有效測定面積,m2;t為測量間隔時間,d;L為膜的厚度,mm;ΔP為膜兩側的水蒸汽壓差,kPa;m1為膜+試管+無水氯化鈣的原始重量,g;m2為2 d后膜+試管+無水氯化鈣的重量,g。

1.2.8 粘度測定 采用旋轉粘度計進行膜液的粘度測定,具體步驟:先對粘度計進行校準,隨后潤洗轉子,將轉子置于膜液中,設置轉速為6 r/min,待讀數(shù)穩(wěn)定時,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.9 抑菌實驗 將指示菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌均劃線活化,挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用移液槍分別移取0.1 mL菌液,轉接到含不同濃度槐糖脂的液體培養(yǎng)基中,適宜溫度,160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。采用稀釋平板涂布法進行菌落計數(shù),具體步驟:吸取0.5 mL培養(yǎng)液,進行10倍梯度稀釋,選擇3個合適的稀釋度,分別吸取0.1 mL稀釋液進行平板涂布,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌放置37 ℃,白色假絲酵母菌放置30 ℃,恒溫培養(yǎng)24 h,觀察生長情況并進行菌落計數(shù)。抑菌率M0可用下式表示[14]:

式(2)

式中,y0表示未加槐糖脂的菌落數(shù),y1表示加槐糖脂的菌落數(shù)。抑菌率越大,抑菌效果越好。

1.2.10 正交實驗設計 在單因素實驗結果基礎上設計正交實驗,見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.11 水果感官評價 參照GB T23351-2009[15]制定出櫻桃感官評級標準(表2)。將櫻桃隨機分為5組,每組10個,分別進行不同的保鮮處理:第1組:將櫻桃置于培養(yǎng)皿上,用稀釋10倍的膜液涂抹果皮,自然風干;第2組:將櫻桃置于培養(yǎng)皿上,用原膜液涂抹果皮,自然風干;第3組:將櫻桃置于錐形瓶中,用制得的保鮮膜覆蓋瓶口;第4組:將櫻桃置于保鮮袋中,密封保存;第5組:不作任何包裹,放置在培養(yǎng)皿上。將上述5組櫻桃室溫貯藏,24 h為周期觀察,記錄櫻桃的形態(tài)變化及腐爛程度,并根據(jù)感官評級標準評分,每組實驗做3個平行,按下列公式計算新鮮指數(shù)[16]:

表2 櫻桃感官評級標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of cherries

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗采用Origin 9.0作圖軟件,SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 普魯蘭多糖量對成膜性能的影響 由表3可得,當普魯蘭多糖濃度為16 g/L時,膜的各項性能良好,低濃度時,膜的厚度變小,膜硬而脆,不易揭下,透水蒸汽性高,性能不穩(wěn)定,高濃度時,透水蒸汽性有所下降,這是由普魯蘭多糖致密的結構所決定的[7],但膜的厚度、粘度增加,膜的成本也相應增加,且透光率下降,故選擇普魯蘭多糖的濃度為16 g/L。

表3 不同濃度普魯蘭多糖對成膜性能的影響Table 3 Effects of different concentrations of pullulan on film performance

2.1.2 甘油量對成膜性能的影響 甘油濃度低于10 g/L時,所成膜較軟,不利于揭膜,濃度的增加可增加膜的柔韌性,利于揭膜,同時,對粘度、水溶性影響不大。甘油是親水物質,與普魯蘭多糖和槐糖脂混合時,嵌入分子中間,降低了分子間作用力,甘油濃度過大,透水蒸汽性增加,膜的穩(wěn)定性降低[17],甘油濃度為10 g/L時,厚度和透光率最大,性能穩(wěn)定,故選擇此濃度為甘油的添加濃度,結果見表4。

表4 不同濃度甘油對成膜性能的影響Table 4 Effects of different concentrations of glycerol on film performance

2.1.3 槐糖脂量對成膜性能的影響 當槐糖脂濃度為2.4 g/L時,膜的水溶性和透水蒸汽性最小,此時膜的致密性和溶解性最好,濃度的改變對厚度、透光率影響較小,當濃度減少時,透水蒸汽性增加,膜性能不穩(wěn)定,隨著濃度的增加,粘度呈增大趨勢,膜與界面張力不斷減小[18],揭膜容易,原因是槐糖脂由親水的槐糖與親油的羥基脂肪酸以縮醛形式結合而成,高濃度槐糖脂使揭膜過程中,膜易與成膜介質分離(表5)。

表5 不同濃度槐糖脂對成膜性能的影響Table 5 Effects of different concentrations of sophorolipids on film performance

2.1.4 槐糖脂量對抑菌性能的影響 本文研究了不同濃度槐糖脂的抑菌效果,結果如表6所示,當槐糖脂濃度為0.8 g/L時,對金黃色葡萄球菌的抑制率達到94.34%,當濃度增加到2.4 g/L時,金黃色葡萄球菌的生長幾乎完全被抑制,具有良好的抑制效果。對大腸桿菌和白色假絲酵母菌也有一定的抑制作用(表6),當槐糖脂濃度為4.0 g/L時,對大腸桿菌的抑菌率為28.75%;對白色假絲酵母菌的抑制效果達14.53%的抑菌率,且在顯微鏡下觀察不到白色假絲酵母菌的菌絲(表6)。有文獻報道,槐糖脂濃度達到3.0 g/L時,可以抑制95%以上空氣中的微生物[19],與本文的研究結果相近。Zhang等[20]研究了不同結構槐糖脂對E.coliO157∶H7的抑制作用時,發(fā)現(xiàn)內酯型較自由酸型、C18較C16的抑菌效果更明顯,與本實驗采用的內酯型含量為70%～80%的C18槐糖脂研究結果一致。金黃色葡萄球菌引起的食品污染僅次于大腸桿菌,與乳制品變質、果蔬腐爛有關[21],胡靜等[22]研究表明,槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理主要作用于菌體生長對數(shù)期,破壞細胞膜和細胞壁的形成。槐糖脂對水果的主要腐敗菌霉菌、酵母菌的抑制效果較好[9],可用于果蔬易受感染的生長發(fā)育期,在運輸過程中延長保質期。Haque等[23]研究表明,槐糖脂可抑制白色假絲酵母菌細胞膜的合成,同時阻礙菌絲的合成,改變細胞形態(tài)。綜合膜的性能分析及對不同菌株的抑菌效果考慮,選擇槐糖脂的濃度為3.2 g/L。

表6 不同濃度槐糖脂的抑菌情況Table 6 Antimicrobial activity of different concentrations of sophorolipid

2.2 正交實驗結果分析

由于正交實驗中所測指標較多,不同性能最佳時成膜條件存在差異(表7),故采用加權求和法來確定膜液配方[4]。由于本文目的是獲得可涂抹于水果表面成膜的膜液,因此對粘度、水溶性和透水蒸汽性的極差結果加權求和,其中透水蒸汽性對膜性能影響最大,故分別賦予權重0.3、0.3、0.4,通過極差分析獲得最佳的成膜配方(表8)。

表7 正交實驗結果Table 7 Results of orthogonal tests

表8 極差分析Table 8 Range analysis

由表8可知,影響保鮮膜性能的主要因素為普魯蘭多糖和槐糖脂的含量。為保證保鮮膜的保鮮和易水洗的性能,應控制透水蒸汽性和水溶性處于較低水平,較低的膜液粘度可以降低膜成本,故選擇粘度、水溶性、透水蒸汽性總體水平最低的配方A3B3C1,即普魯蘭多糖18 g/L、槐糖脂3.6 g/L、甘油8.75 g/L。此時膜的性能為:厚度0.423 mm,粘度5.668 Pa·s,溶解時間130.5 s,透水蒸汽性57.426 g·mm/(kPa·d·m2),透光率34.7%,且不透油(圖1)。

圖1 透油性結果Fig.1 The result of oil transmission rate注:a:抗菌保鮮膜,b:濾紙。

與肖茜等[4]制備的普魯蘭多糖/海藻酸鈉/羧甲基纖維素復合膜相比,膜的厚度基本一致,而膜實際厚度與干燥前的膜液量有關,可根據(jù)保鮮需要增減膜液量以達到不同的厚度;溶解時間基本相同,膜的原料都可溶于水,因此覆蓋于蔬果表面時更易洗去。膜液的粘度明顯小于肖茜等[4]制備的復合膜液,分別為普魯蘭糖18 g/L時5.4 Pa·s和20 g/L時18.0 Pa·s。膜液脫氣泡更加容易,降低了生產成本。較于陳達佳等[24]制備的膠原蛋白/殼聚糖復合膜,透水蒸汽性相差不大,阻隔性能較好,且本實驗所制得的膜同樣不透油,可用于含脂類食品的保鮮。與高丹丹等[6]制備的普魯蘭多糖/明膠復合膜相比,膜的透光率有所降低。綜上所述,與其他多糖保鮮膜相比,利用普魯蘭多糖、槐糖脂和甘油為原料的膜液粘度更小,且所成膜不透油,透水蒸汽性和水溶性均達到相同水平。

2.3 感官測評

實驗結果顯示,對照組和稀膜液組的櫻桃72 h時出現(xiàn)個別霉變現(xiàn)象,原膜液、抗菌保鮮膜和塑料保鮮袋組在120 h內保鮮效果較好,水果未出現(xiàn)霉變。以新鮮指數(shù)為指標,得到水果的感官評分(圖2)。從圖中可以看出,隨著保鮮時間的延長,各組櫻桃的新鮮指數(shù)隨之降低,反映水果的新鮮度下降。96 h后,本實驗制得的抗菌保鮮膜和市面上的塑料保鮮袋無顯著差異,而保鮮膜、原膜液、保鮮袋與對照組之間差異極顯著(p<0.01),稀釋10倍的膜液與對照組差異不顯著(p>0.05)。說明原膜液及所制抗菌保鮮膜均與塑料保鮮袋的保鮮效果相當,可用于水果的短期保鮮。顯著性分析顯示,120 h后,保鮮袋、保鮮膜和原膜液的新鮮指數(shù)與稀釋膜液和對照組之間差異極顯著(p<0.01)。結果說明,將水果放在同一環(huán)境中處理相同的時間,相對于直接暴露在空氣中的水果,所制膜液及抗菌保鮮膜都有明顯的保鮮效果。張艷梅等[16]在低溫條件下利用魔芋葡甘聚糖復合膜對青椒保鮮30 d的實驗中,15 d時實驗組保鮮效果明顯優(yōu)于常溫對照組,30 d時涂膜組青椒的衰老指數(shù)(新鮮指數(shù))與對照相差34.5%。本實驗中處理時間為120 h時,原膜液、保鮮膜、保鮮袋新鮮指數(shù)與對照組相差40%～50%,說明原膜液和保鮮膜均有良好的保鮮效果。

圖2 不同保鮮處理的櫻桃新鮮指數(shù)隨時間的變化Fig.2 The freshing index of different cherry preservation treatment

3 結論

本研究通過單因素實驗及正交實驗分析,得到抗菌保鮮膜的最佳原料配比,普魯蘭多糖18 g/L、槐糖脂3.6 g/L、甘油8.75 g/L,干燥成膜溫度60 ℃,在此條件下,所得保鮮膜的性能最佳。槐糖脂對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、白色假絲酵母菌(C.albicans)都有一定的抑制效果,其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為明顯,當槐糖脂濃度大于2.4 g/L時,幾乎完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。

櫻桃通過涂抹保鮮膜膜液和抗菌保鮮膜覆蓋的新鮮指數(shù)明顯較高,衰老腐爛的速度較慢,可能所制抗菌保鮮膜在鎖住水分、阻隔氧氣方面有一定的作用。與傳統(tǒng)的塑料保鮮膜相比,由微生物發(fā)酵所得的普魯蘭多糖和槐糖脂及甘油為原料制得的抗菌保鮮膜,生物可降解性、食品保鮮性、抑菌性均有較好的改善和提高,可直接涂抹在果蔬表面成膜,便于果蔬的日常保鮮貯藏,延長保鮮期,具有廣闊的發(fā)展前景。

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