鹽雞鹵汁酶解工藝優化及 氨基酸組成分析

王海丹,成亞斌,宋賢良,葉盛英,羅樹燦

(華南農業大學食品學院,廣東省食品質量安全重點實驗室,廣東廣州 510642)

鹽焗雞是具有嶺南特色的傳統風味熟肉制品,具有皮爽脆、肉嫩滑的特點,深受消費者的喜愛[1-2]。鹽焗雞在傳統干法手工制作的基礎上,通過工藝革新逐步實現以濕法加工為主的工業化生產。鹵制是鹽焗雞工業化加工的重要工序,在此過程中,鹵汁會反復多次使用,每次鹵制時雞肉中雞油、蛋白質(主要是膠原蛋白)和一些可溶性物質會溶入鹵汁中,與香辛料和各種其他添加劑的風味成分溶于一體,使鹵汁中營養物質十分豐富,風味獨特[3-4]。但同時也會造成蛋白質富集。本課題組前期研究表明[5-6],當鹵制達到7次后,鹵汁中可溶性蛋白達到飽和,會影響鹽焗雞的加工品質,如蛋白質會附著在雞肉表面,冷卻后形成蛋白胨,使其口感受到影響。因此鹽焗雞生產中,鹵汁經多次使用后往往當作廢棄物排放,這不僅造成大量營養成分流失,而且也會引起環境污染問題。

目前,關于熟肉制品(鹽水鴨、鹽焗雞、鹵鴨等)鹵汁的研究主要是集中于其營養成份和風味物質的分析方面[7-10],而對鹵汁的酶水解和回收利用技術的研究則鮮見報道。鹽焗雞鹵汁中含有豐富的蛋白質、脂肪酸、氨基酸及風味物質,特別是游離氨基酸含量非常高[11]。游離氨基酸不僅直接形成滋味,而且還是很多風味物質的前體物質[12-14]。雞肉中膠原蛋白含量豐富,提取溶出率高,因此鹵汁中膠原蛋白含量也很高,但是膠原蛋白在溫度較低時結成胨狀,使得鹵汁難以利用。通過酶水解可將鹵汁中的膠原蛋白降解成為氨基酸和多肽,不僅能豐富鹵汁的風味,發揮出獨特的營養功效和功能特性[15-20],而且也為鹵汁的回收利用創造條件。

本文采用動物復合蛋白酶對經7次鹵制后的鹽焗雞鹵汁進行酶解并優化其酶解工藝,進一步分析了酶解后鹵汁中氨基酸組成,以期為鹽焗雞鹵汁的回收利用奠定基礎并提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白羽雞中翅 帶皮,雞齡52 d,廣州卜蜂蓮花超市某批次冷凍雞翅;鹵料 廣東好味來食品有限公司;動物復合蛋白酶(包括內切蛋白酶、外切蛋白酶,風味酶等) 酶活力12萬U/g,廣西龐博生物科技有限公司;其他試劑 均為分析純,廣州化學試劑廠。

L-8800型全自動氨基酸分析儀、855-350型色譜柱(4.6 mm×60 mm) 日本Hitachi公司;AL204電子分析天平 瑞士Metter-Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹵汁配制 將鹵料以沙姜0.5%,小茴香0.2%,香葉0.4%的比例配制,加水煮沸,慢火熬煮60 min,再添加調味料(NaCl的加入量為1%,乙基麥芽酚為1%,味精為0.4%,核苷酸二鈉(I+G)為0.021%,紅曲黃色素添加量為0.025 mg/mL)調配成鹵汁原汁。每次以料液質量比1∶5的比例將焯水的雞翅置于80 ℃鹵汁原汁中鹵煮45 min,經7次鹵制后得到鹵汁回收液。

1.2.2 鹵汁回收液酶解工藝 鹵汁回收液→過濾→取過濾液→調節pH→加酶水解→攪拌→滅酶→離心→取上清液測定氨基酸態氮和總氮含量。

操作要點:

過濾:采用定性濾紙濾掉鹵汁中的碎骨肉及香辛料殘渣;

調節pH:取25 mL濾液,滴加1.0 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液,將鹵汁的pH調至設一定值(5～9);

加酶水解:往鹵汁中加入一定量的動物復合蛋白酶,置于一定溫度的怛溫水浴鍋中進行水解反應;

滅酶:反應完成后將水解液置于沸水浴中加熱15 min,使酶失活;

離心:將滅酶后的水解液于轉速為5000 r/min離心15 min,取上清液進行測試。

1.2.3 單因素實驗方案 固定酶解溫度為50 ℃,酶解時間為6 h,pH為7.0,考察酶用量為0、2400、4800、7200、9600、12000、14400、16800 U對鹵汁回收液水解度的影響;固定酶用量為12000 U,酶解時間為6 h,pH為7.0,考察酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃對鹵汁回收液水解度的影響;固定酶用量為12000 U,酶解溫度為50 ℃,pH為7.0,考察酶解時間為2、4、6、8、10、12 h對鹵汁回收液水解度的影響;固定酶用量為12000 U,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為6 h,考察pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0對鹵汁回收液水解度的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 以水解度(DH)為評價指標,采用Box-Behnken進行優化設計,采用Design-Expert(Version 8.0.5b)軟件進行數據處理和回歸分析,對鹽焗雞鹵汁的酶法水解工藝條件進行優化,實驗因素水平編碼值見表1。

表1 響應面分析實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.5 氨基酸態氮和總氮含量測定 氨基酸態氮含量測定,參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》;總氮測定,參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》進行;水解度(DH)計算:

式中:A為水解后的氨基酸態氮含量,g/100 g;A0為水解前的氨基酸態氮含量,g/100 g;N為總氮含量,g/100 g。

1.2.6 游離氨基酸含量測定 取稀釋后的鹵汁溶液1 mL,加入等體積的濃度為6 g/100 mL的5-磺基水楊酸,反應1 h后于14000 r/min離心15 min。取上清液,過濾后采用氨基酸分析儀進行分析。測試條件:855-350型色譜柱(4.6 mm×60 mm);柱溫134 ℃;雙通道紫外檢測波長440和570 nm;進樣量20 μL,時間148 min。根據氨基酸標準物質的質量濃度與峰面積的關系,外標法定量鹵汁樣品中的氨基酸組分,單位以g/100 g表示。

1.3 數據處理

采用SPSS 20軟件進行相關數據的統計分析,采用Origin 8.5軟件進行作圖分析,每組實驗重復三次,結果均以平均值(標準差表示。用Duncan’s新復極差測驗(SSR法)檢驗在0.05水平下的差異顯著性(n=3)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

由圖1可知,不加蛋白酶時,由于雞肉蛋白中具有少量內源性蛋白酶[20],蛋白質有所水解,但水解度不高。加入蛋白酶后,水解度顯著增大(p<0.05),隨著蛋白酶用量的增加,酶對蛋白質的水解作用增強,水解度呈不斷上升的趨勢。當加酶量超過12000 U時,水解度無明顯增加(p>0.05)。可能原因是當加酶用量達到一定值時,酶與蛋白質的結合位點達到飽和[21],再繼續增大酶用量,水解反應速度幾乎沒有變化。在實際生產中,從經濟性考慮,確定加酶量為12000 U。

圖1 酶添加量對鹵汁酶水解度的影響Fig.1 Influence of proteinase dosage on the degree of hydrolysis注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖4同。

圖2表明,鹵汁初始pH在5.0～7.0之間時,水解度隨著pH升高,呈逐漸上升趨勢;pH為7.0時,鹵汁水解度達到最大,為15.37%;此后繼續增大初始pH,水解度下降。這是由于pH是決定酶催化活性的重要參數之一,它可以影響酶與底物的結合與催化,且動物復合蛋白酶有其最適的pH范圍,當pH過大時,部分蛋白酶的構象發生改變,使其活性降低[22]。

圖2 pH對鹵汁酶水解度的影響Fig.2 Influence of pH on the degree of hydrolysis

從圖3可看出,當酶解溫度低于50 ℃時,水解度隨著溫度升高顯著增大(p<0.05),當溫度為50 ℃時,水解度達到最大(15.27%),此時再升高溫度,水解度降低。可見,在酶解過程中,適當提高溫度可增加酶的活力;但當溫度過高時,酶受熱使其構像被破壞,酶的穩定性下降,酶解效率也隨之降低[23]。

圖3 酶解溫度對鹵汁酶解的影響Fig.3 Influence of temperature on the degree of hydrolysis

圖4為酶解時間對鹵汁水解度的影響。隨著酶解時間延長,鹵汁的水解度逐漸增大,當酶解時間達到6 h后,水解度增加幅度趨于平緩。這是因為蛋白分子上的酶作用位點隨著時間的延長而逐漸減少,同時酶解產物的累積抑制酶促反應的進行[24]。

圖4 酶解時間對鹵汁酶解的影響Fig.4 Influence of time on the degree of hydrolysis

2.2 酶解工藝優化

根據單因素實驗結果,從實際生產出發,選取合適的溫度和時間對于節能減排和經濟效益的意義較大,故選擇酶解pH、酶解溫度、酶解時間3個因變量為考察因素,以DH為評價指標,酶用量為12000 U,對鹵汁酶解工藝條件進行優化。表2是17個實驗組合點以及對應的實驗結果,17個實驗點包括12個析因點和5個零點。酶解工藝優化實驗以鹵汁水解度為響應值(R),利用Design Expert 8.0.5b軟件進行二次多元回歸擬合,得到了回歸方程模型方差分析(表3)及回歸方程系數顯著性檢驗(表4)。

表2 Box-Behnken實驗設計及其結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Table 4 Significance Test of Coefficient of Regression Equation

由表3、表4可知,通過Design Expert8.0.5b軟件對表2數據進行非線性回歸二次多項式擬合,得到預測模型為:

R=15.29-0.099A+0.085B+0.51C-1.59A2-1.44B2-0.33C2-0.22AB-0.17AC-0.37BC。

由表4亦可知,酶解時間、酶解初始pH 2個因素對鹵汁酶解效果的影響均顯著(p<0.05),其中酶解初始pH對鹵汁酶解效果的影響達到極顯著水平(p<0.01)。酶解時間和酶解溫度、酶解時間與酶解pH及酶解溫度和酶解pH有顯著交互作用。交互作用響應面圖見圖5～圖7。

從圖5可以看出,當pH一定時,在選定的條件范圍內,鹵汁水解度較高值在酶解溫度45～55 ℃,酶解時間為5～7 h的范圍內,當酶解溫度小于50 ℃,酶解時間小于6 h時,隨著酶解溫度升高,酶解時間延長,鹵汁水解度大幅度上升,表現為響應面圖的陡峭上升趨勢;當酶解溫度大于50 ℃,酶解時間大于6 h時,隨著溫度升高,時間延長,水解度呈下降趨勢。說明最佳酶解溫度和最佳酶解時間都在實驗選定范圍內。

圖5 酶解時間與酶解溫度對水解度的影響Fig.5 Influence of enzymolysis time and temperature on the degree of hydrolysis

圖6表明,當酶解溫度一定時,在選定的條件范圍內,鹵汁水解度較高值在酶解初始pH7.0～7.5,酶解時間為6 h左右的范圍內,當pH大于6.0,酶解時間小于6 h時,隨著pH升高,酶解時間延長,響應面圖呈陡峭上升趨勢,當pH大于7.5時,增速減緩,酶解時間大于6 h時,鹵汁水解度不斷下降。

圖6 酶解初始pH和酶解時間對水解度的影響Fig.6 Influence of initial pH and enzymolysis time on the degree of hydrolysis

由圖7可知,當酶解時間一定時,隨著pH增大,酶解溫度升高,水解度呈先上升后下降的變化趨勢,鹵汁水解度較高值在pH7.0～7.5,酶解溫度為45～55 ℃的范圍內。

圖7 酶解初始pH與酶解溫度對水解度的影響Fig.7 Influence of initial pH and enzymolysis temperature on the degree of hydrolysis

采用Design Expert 8.0.5b軟件進行分析,可以求得水解度預測值為15.46%的優化酶解條件為:酶解pH7.60、酶解時間5.90 h、酶解溫度48.37 ℃。為了方便實際生產時容易控制,設定實際操作中酶解pH為7.6、酶解時間為6 h、酶解溫度為48 ℃,進行3次重復驗證實驗,測得鹵汁水解度平均值為14.73%±0.63,與預測結果相近,驗證實驗進一步確證了鹵汁酶解的最優條件。

2.3 酶解工藝對鹵汁回收液中氨基酸成分的影響

對酶解前后的鹵汁回收液中氨基酸成分進行檢測,檢測結果見表5。

表5 酶解前后鹵汁回收液中氨基酸組分及其含量(mg/L)Table 5 Amino acids composition and their contents in marinade before and after enzymatic hydrolysis(mg/L)

續表

由表5可知,酶解前的鹵汁中氨基酸種類為25種,其中包含有八種人體必需氨基酸、各種鮮味氨基酸及藥效氨基酸,氨基酸主要來源于雞肉、香辛料及添加的鮮味劑等方面。酶解后的鹵汁中氨基酸種類增加為30種,增加了磷酸絲氨酸、磷酸乙醇胺、α-氨基已二酸、α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、胱氨酸,與陳怡穎等[25]研究結果相符,而乙醇胺則沒有在酶解后的鹵汁中檢測出,這是由于在酶解前使用NaOH和HCl溶液調節鹵汁的pH以保證酶的催化活性,而乙醇胺會與其反應生成其他非氨基酸類物質[26]。α-氨基已二酸廣泛應用于醫藥、食品、飼料、化妝品工業等領域,也被用作合成特殊化學物質的中間體,如低熱質甜味劑、鰲合劑以及多肽,此外,它還是賴氨酸合成途徑的一個代謝中間產物,并與由瓜氨酸向精氨酸的氨基化有關。α-氨基丁酸和β-氨基丁酸是酶解的中間產物,由谷氨酸脫羧后生成。胱氨酸為氨基酸類藥物,能促進細胞氧化還原功能,使肝臟功能旺盛,并能中和毒素、促進白細胞增生、阻止病原菌發育[27]。

酶解后的鹵汁中不僅氨基酸的種類增加,各類氨基酸的含量出現了較大的增長。酶解后的氨基酸總量相比于酶解前增加了3.67倍,必需氨基酸含量增加了9.56倍,鮮味氨基酸和藥效氨基酸由于包含了谷氨酸,基數較大,增加幅度相對較小,其中鮮味氨基酸增加了2.7倍,藥效氨基酸增加了3.06倍。

酶解鹵汁中具備功能活性的非蛋白氨基酸含量也有明顯增加,如γ-氨基丁酸、肌肽等。其中,γ-氨基丁酸增加幅度較小,僅增加2.76倍。而肌肽含量增加較多,酶解后的肌肽含量由41.66 mg/mL增加至327.10 mg/mL,增加了6.98倍。γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然活性成分,為非蛋白質氨基酸,具有鎮靜神經、抗焦慮、降血壓、改善腦機能,具增強記憶力、改善失眠等功效[28-29]。與劉玉凌等[30]研究結果相符,酶解后制得的雞肉湯所含的低分子揮發性風味成分的種類和含量遠比未經水解的雞肉制得的多。肌肽是一種天然的生物活性肽,它廣泛存在于動物的肌肉中,主要組成是β-丙氨酰和L-組氨酸。研究表明肌肽不僅能夠影響食品風味的形成,還具備抗氧化、調節免疫、抗衰老、抗癌等多種活性功能[31-32]。

3 結論

本實驗通過單因素和響應面實驗優化,確定鹽焗雞鹵汁酶法水解的最優工藝條件為:酶用量12000 U,酶解溫度48 ℃,pH7.6,酶解時間6 h,此條件下鹵汁水解度為14.73%,模型預測值為15.46%,誤差為0.73%。表明采用響應面法優化的水解工藝參數可靠,有較好的實用價值。

酶解后鹵汁中游離氨基酸種類達到30種,主要包含有8種人體必需氨基酸、鮮味氨基酸和藥效氨基酸,與酶解前相比,新增氨基酸5種,氨基酸總量增加了3.67倍,必需氨基酸含量增加了9.56倍,鮮味氨基酸、藥效氨基酸及肌肽含量分別增加了2.7倍、3.06倍、6.98倍。

[1]楊萬根,孫會剛,王衛東,等. 鹽焗雞翅生產工藝優化[J]. 食品科學,2010,31(20):522-526.

[2]宋賢良,成亞斌,黃凱信,等. 精煉鹽焗雞鹵汁分離雞油的基本特性[J]. 食品與發酵工業,2015,41(6):155-158.

[3]杜壘,謝偉,徐幸蓮,等.復鹵前后鹽水鴨老鹵基本成分與安全指標變化[J]. 食品科學,2009,30(13):101-104.

[4]曹寶忠,蘇迎會,許新軍. 鹽漬菜鹵汁綜合利用技術研究[J]. 中國調味品,2011(2):78-82.

[5]黃凱信,陳慶,宋賢良,等. 鹽焗雞鹵汁分離雞油脫酸工藝的研究[J]. 中國調味品,2013,38(3):36-40.

[6]成亞斌,黃凱信,宋賢良,等. 不同鹵制次數的鹽焗雞鹵汁中的營養成分變化規律[J]. 食品與發酵工業,2014,40(3):129-133.

[7]劉登勇,謝偉,徐幸蓮. 鹽水鴨鹵水中揮發性物質用其風味特性分析[J]. 食品研究與開發,2011,32(4):118-121.

[8]黃凱信,陳慶,宋賢良,等. 鹽焗雞鹵汁基本成分及風味物質分析[J]. 食品科學,2013,34(12):254-265.

[9]丁安子,喬宇,汪蘭,等. HS-SPME分析醬鹵鴨脖鹵湯揮發性成分[J]. 湖北農業科學,2017,56(3):919-923.

[10]劉登勇,劉歡,戚軍,等. 扒雞鹵湯基本營養成分在反復鹵煮過程中的變化規律[J]. 食品工業科技,2016,37(24):176-180.

[11]黃凱信,陳慶,宋賢良,等. 響應面法優化鹽焗雞鹵汁分離雞油脫色工藝的研究[J]. 食品工業科技,2012,33(19):243-246.

[12]Zeng X F,Bai W D,Zhu X W,et al. Browning intensity and taste change analysis of chicken protein-sugar maillard reaction system with antioxidants and different drying processes[J]. Journal of Food Processing and Preservation,2017,41(2):1-7.

[13]Dinesh D J,Sun H K,Hyun J L,et al. Comparison of the amounts of taste-related compounds in raw and cooked meats from broilers and Korean native chickens[J]. Poultry Science,2014,93(12):3163-3170.

[14]Sun W,Zhao M,Cui C. et al. Effect of Maillard reaction product derived from the hydrolysate of mechanically deboned chicken residue on the antioxidant,textural and sensory properties of Cantonese sausage[J]. Meat Sci,2010,86:276-282.

[15]Wu Q Y,Xiong X T,Zhang X L,et al. Secondary osteoporosis in collagen-induced arthritis rats[J]. Journal of Bone and Mineral Metabolism,2016,34(5):500-516.

[16]Zhuang Y L,Sun L P,Zhao X,et al. Antioxidant and melanogenesis-inhibitory activities of collagen peptide from jellyfish(Rhopilema esculentum)[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2009,89(10):1722-1727.

[17]Jing A,Bo L. Amino acid composition and antioxidant activities of hydrolysates and peptide fractions from porcine collagen[J]. Food Science and Technology International,2012,18(5):425-434.

[18]Wang L,Wang Q,Liang Q F. Determination of bioavailability and identification of collagen peptide in blood after oral ingestion of gelatin[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2015,95(13):2712-2717.

[19]Wang J B,Zhang Z F,Pei X R,et al. Effects of marine collagen peptides on blood glucose and lipid metabolism in hyperinssulinemic rats[J]. Journal of Hygiene Research,2010,39(2):254-262.

[20]朱瀛,趙改名,柳艷霞,等. 中性蛋白酶水解雞骨泥制備短肽工藝優化[J]. 農業工程學報,2016,32(12):309-314.

[21]Udeninwe C C,Mohan A,Wu S H. Peptide aggregation during plastein reaction enhanced bile acid-binding capacity of enzymatic chicken meat hydrolysates[J]. Journal of Food Biochmistry,2015,39:344-348.

[22]孫月梅. 大豆抗氧化肽酶法制備及其活性保護技術研究[D]. 哈爾濱:東北農業大學,2008.

[23]Onuh J O,Girgih A T,Aluko R E,et al. Inhibitions of renin and angiotensin converting enzyme activities by enzymatic chicken skin protein hydrolysates[J]. Food Research International,2013,53:260-267.

[24]薛蕾.苦杏仁蛋白及抗氧化活性肽制備工藝研究[D]. 楊凌:西北農林科技大學,2012.

[25]陳怡穎,丁奇,趙靜,等. 雞湯及雞肉酶解液中游離氨基酸及呈味特性的對比分析[J]. 食品科學,2015,36(16):107-111.

[26]賀繼銘. 國內外乙醇胺生產現狀及發展趨勢[J].石油化工技術經濟,2007,23(4):58-62.

[27]毛慶祥,楊天德. 胱氨酸/谷氨酸反向轉運體的研究進展[J]. 生理學進展,2014,45(6):434-438.

[28]Priscila Del Campo C,Garde-Cerdan T,Sanchez A M,et al. Determination of free amino acids and ammonium ion in saffron(CrocussativusL.)from different geographical origins[J]. Food Chemistry,2009,114(4):1542-1548.

[29]Lamberts L,Rombouts I,Delcour J A. Study of nonenzymic browning in alpha-amino acid and gamma-aminobutyric acid/sugar model systems[J]. Food Chemistry,2008,111(3):738-744.

[30]劉玉凌,陳雅韻,夏楊毅. 酶解雞湯熬制過程中蛋白質和氨基酸的變化[J]. 食品工業科技,2015,36(24):235-238.

[31]Rashid I,van Reyk D M,Davies M J. Carnosine and its constituents inhibit glycation of low-density lipoproteins that promotes foam cell formationinvitro[J]. FEBS Letters,2007,581(5):1067-1070.

[32]Boldyrev A A,Aldini G,Derave W. Physiology and pathophysiology of carnosine[J]. Physiological Reviews,2013,93(4):1803-1845.