植物源食品中葉酸的生物合成與調控及其 提取與檢測技術研究進展

任文芳,楊潤強,顧振新,王 沛

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

葉酸是指四氫葉酸(THF)及其衍生物,為一種水溶性B族維生素,是生物體的必需成分[1]。葉酸作為一碳代謝中一碳(C1)轉移反應的輔因子,參與核苷酸生物合成,氨基酸代謝(如,絲氨酸轉換為甘氨酸、組氨酸的分解)和甲基化循環(如,同型半胱氨酸通過再甲基化轉變為甲硫氨酸),其中在甲基化循環時提供了許多甲基及甲基化反應。因此,葉酸及其合成通路對細胞代謝至關重要。人體自身無合成葉酸的能力,只能通過飲食攝取。為滿足正常生命活動的需要,成年人每天應補充400 μg的葉酸,而孕婦每天應補充600 μg[2]。業已證實葉酸攝入不足則引發巨幼紅細胞貧血和胎兒神經管發育缺陷(NTD)[3],且低水平的葉酸攝入與老年癡呆癥、心血管疾病和多種癌癥的發生密切相關[4]。因此,葉酸對人體正常生命活動十分重要。

為緩解世界范圍內普遍存在著的人體葉酸缺乏狀況,提高植物性食品原料中葉酸的含量具有現實意義。近年來,植物中葉酸生物合成途徑研究,以及通過基因工程和發芽調控手段提高葉酸含量已成為研究熱點,隨之,植物源食品中葉酸的提取與檢測也要求更高的準確度及精確度。本文綜述了植物源食品中葉酸的類型與結構、葉酸合成途徑及相關酶、葉酸代謝調控、發芽富集技術、葉酸提取與檢測技術,以期為開發富含葉酸的健康食品提供理論依據。

1 葉酸類型及其結構

葉酸分子由2-氨基-4-羥基蝶啶(蝶呤)、對氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸[5]三部分組成(圖1)[10]。葉酸分子存在多種形式,

圖1 葉酸的化學結構Fig.1 The chemical structure of folate

理論上達150種之多[6],在植物和動物組織中僅發現不到50種。蝶呤環有完全氧化及部分還原、完全還原形式[1],各種氧化水平的C1基團(甲酰基、亞甲基、甲基等)可以連接于蝶呤的N-5位置或pABA的N-10位置,或是連接在二者之間(表1)[7],產生的C1取代的葉酸經酶促反應可以相互轉化,并且可用作各種反應的C1基團供體。

表1 葉酸常見種類Table 1 The common species of folate

植物體內谷氨酸尾數從1～8個不等[2],谷氨酸殘基通過γ位通常連接到第一個谷氨酸上。其中,單谷氨酸尾形式的葉酸是葉酸轉運體所偏好的形式,多谷氨酸尾形式的葉酸則是葉酸依賴型酶所偏好的形式[8]。此外,由于尾部促進葉酸與酶的結合,而葉酸對于氧化裂解在結合時比在游離時更穩定,所以多聚谷氨酰化可以直接增強葉酸穩定性[9]。

2 葉酸合成途徑及相關酶

葉酸存在于植物細胞的液泡、細胞質、線粒體和質體中[11],但葉酸僅在線粒體中合成,蝶呤和pABA前體則分別在細胞質和葉綠體中形成(圖2)[12]。

圖2 植物中葉酸的合成Fig.2 The biosynthesis of folate in plant

2.1 蝶呤合成

尿苷三磷酸(GTP)在GTP環化水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCHI)作用下轉化為二氫新蝶呤三磷酸,該反應是喋呤合成的第一步,也是其合成的限速反應。在植物體中,GCHI是具有兩個串聯結構域的同二聚體,其中每個結構域類似于典型的GCHI單體[13-14],然后GCHI催化產生的二氫新蝶呤三磷酸產物在兩個步驟中被去磷酸化形成二氫蝶呤,后又被二氫蝶呤醛縮酶水解成6-羥甲基二氫蝶呤(HMDHP)和乙醇醛[15]。

2.2 pABA合成

pABA在葉綠體中合成,并在線粒體中作為前體合成葉酸。pABA合成的前體物質是分支酸,該物質只能在質體中合成,是莽草酸途徑的重要中間代謝產物。在氨基脫氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADCS)和氨基脫氧分支酸裂解酶(aminodeoxychorismate lyase,ADCL)催化下,分支酸生成pABA。pABA可在胞質中葡萄糖醛轉移酶的催化下可逆地轉化成其葡萄糖脂,且植物中全部或大多數pABA發生了酯化反應,以致酯化形式的pABA通常比游離的pABA多,通過合成反應的逆轉或酯酶作用,酯可以再轉化為pABA[16]。盡管這一酯化反應的生理作用尚不清楚,但是植物特有,可能為pABA提供了一種貯存形式,也可能是pABA在植物細胞中的特殊運輸形式[12]。

2.3 葉酸的生物合成

合成的喋呤復合物HMDHP和pABA前體被轉運到線粒體中,其中HMDHP首先在羥甲基二氫喋呤焦磷酸化酶的作用下通過焦磷酸化活化,然后經二氫蝶酸合成酶催化偶聯到pABA以產生二氫蝶酸。二氫蝶酸進一步在二氫葉酸合成酶(dihydrofolate synthase,DHFS)催化下形成單谷氨酸二氫葉酸。二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)協助下將二氫葉酸還原為單谷氨酸四氫葉酸,最后通過葉酰多谷氨酸合成酶(folypolyglutamate synthase,FPGS)的作用與谷氨酸結合,合成多谷氨酰四氫葉酸。其中,羥甲基二氫喋呤焦磷酸化酶和二氫蝶酸合成酶是植物中單個雙功能蛋白的兩個結構域[17]。DHFS是特殊的植物葉酸合成酶,其功能已經由突變體研究確定,編碼DHFS的擬南芥基因的破壞會導致葉酸缺乏,并且有胚胎致死效應[18]。

3 葉酸代謝調控

植物性食品原料,如大豆、水稻、番茄中含有微量的葉酸,可以通過基因工程、種子萌發等方法使葉酸得以富集,以此提高植物源食品的營養與保健價值。

3.1 基因工程

利用基因工程手段可有效地增加植物中的葉酸。目前已在大豆、水稻、番茄等植物中導入外源編碼的GCHI、ADCS等基因,葉酸富集效果顯著[19]。

3.1.1 過表達GCHI 在番茄[20]和擬南芥[21]]的研究中,使用非植物基因(基于哺乳動物或細菌基因)過表達葉酸合成途徑中蝶啶分支的第一個酶,即GCHI,該酶無反饋抑制,轉基因番茄和擬南芥中的蝶啶水平分別是野生型對照組的140和1250倍;然而,葉酸含量僅分別是野生型對照組的2和4倍,說明僅過表達一個分支的酶只是使該途徑產物大量積累,并不能使葉酸產量大幅增加。當增加外源性pABA到過表達GCHI的轉基因番茄和擬南芥中,葉酸含量則在此基礎上增加2.5～10倍。此結果不僅指出增加葉酸前體物質—蝶呤和pABA的必要性,同時也表明在植物細胞內提高葉酸具有較大的生物潛力。

3.1.2 聯合過表達GCHI與ADCS 在番茄[22]中過表達與pABA分支途徑中的第一個酶-ADCS的相關基因,與野生型相比較,轉基因果實中含有約19倍的pABA,葉酸水平沒有增加,然而通過雜交將pABA過量產生性狀與蝶呤過量產生性狀相結合,得到的雙轉基因果實中葉酸含量比對照多19倍,達到840 μg/100 g,完全滿足一個成人的日常需要量。但是,這也導致了高劑量的蝶呤和pABA,約為野生型的20倍。雖然轉基因番茄中高pABA水平對人體健康無害,但蝶呤的作用并不清楚[23]。

在水稻胚乳單個遺傳基因組上的強特異性啟動子控制下,擬南芥中編碼GCHI和ADCS的基因得到過表達,可實現葉酸的生物強化[24]。選用可能存在負反饋調節的植物GCHI,可避免非理想型中間體的高積累。與野生型相比,過表達擬南芥基因的轉基因水稻葉酸含量高達100倍,且生物合成中間體—蝶呤和pABA的水平顯著低于轉基因番茄。在強化葉酸的番茄和水稻中,葉酸:pABA:蝶呤的摩爾比分別為1∶2.5∶0.75和1∶0.5∶0.013[25],說明在強化水稻中沒有像在強化番茄中高劑量的中間產物的積累。因此,植物GCHI的使用可能保留了其固有的負反饋調節,而與植物ADCS聯用,可使酶活趨向于平衡,能獲得蝶呤和pABA的最佳通量。

在雙子葉植物(番茄)和單子葉植物(水稻)進行的葉酸生物強化實驗證明同時增強蝶呤和pABA分支可能適用于其他植物強化葉酸。

3.2 發芽調控

種子萌發后,生命代謝活動開始,植物體內大量酶原被激活,其內部發生一系列生理生化變化,如在豆類植物中,脂類物質在酶的作用下被分解成甘油和脂肪酸,最后生成能夠被人體吸收的糖類;蛋白質水解為多肽和氨基酸[26],這有利于人體吸收;維生素[27]、γ-氨基丁酸[28]、異黃酮[29]等生理活性成分含量相應提高。因此,芽類食品的保健功能在食品行業獨樹一幟,頗受人們歡迎。

植物種子在發芽后,葉酸含量明顯增加。據Koehler等[30]的研究發現,小麥在20 ℃下發芽102 h后,每100 g干物質中增加了200 μg葉酸,比未發芽者增加了3.6倍;100 g干麥芽含有每日建議攝入葉酸量(400 μg)的50%。Hefni等[31]發現小麥發芽4 d后,其葉酸含量是原來的4倍,黑麥是原來的6倍,說明發芽對黑麥葉酸含量影響更為顯著。黑麥比小麥、大麥和燕麥等其他谷物含有更多的葉酸[32]。Kariluot[33]研究了發芽溫度對黑麥中葉酸的影響,發現在一定溫度范圍內,葉酸含量隨發芽溫度升高而升高,提示合適的發芽條件有利于植物富集葉酸。Shohag等[34]的研究結果表明,發芽對2個大豆品種及2個綠豆品種葉酸含量的差異是由遺傳因素決定的;各品種的葉酸含量在發芽4 d時達到最大值,之后下降。由此看來,高葉酸濃度僅出現在發芽的早期階段。Hefni等[35]研究了蠶豆和鷹嘴豆在發芽期間的葉酸含量變化,發現浸泡后葉酸含量下降,而發芽4 d后葉酸增加2.5倍,且葉酸總量的增加主要來源于還原形式葉酸含量的增加,其余形式的葉酸未見增長。谷物及豆類在發芽期間對甲基(一碳單位)的需求增加從而使葉酸合成加快[36]。從這些研究結果中我們不難發現,調控發芽條件是植物富集葉酸的有效方式,且發芽富集葉酸的效果顯著,方法簡便易行,在實際生產中具有較大的應用潛力。

3.3 其他調控方法

除基因工程、發芽調控等手段提高植物中葉酸含量外,還可從認識葉酸轉運蛋白、增強葉酸穩定性、加強葉酸補救途徑等方面入手[10]。

認識和鑒定葉酸轉運蛋白,可將葉酸合成前體物質高效率地轉入線粒體中,以及促進葉酸在液泡等不含有葉酸合成相關酶的亞細胞區域內儲存,從而避免葉酸大量積累造成的反饋抑制,最終增加植物中葉酸含量。由于5-甲酰四氫葉酸較其他葉酸形式具有高穩定性,阻斷將其轉化為其他形式葉酸的酶相關基因的表達,可增強5-甲酰四氫葉酸及葉酸的積累。植物果實成熟后蝶啶大量氧化[37],引入外源蝶啶還原酶可使其再度用于葉酸合成,有助于增強葉酸補救能力。

4 葉酸提取和檢測技術研究

植物性食品原料中葉酸含量較低,并受植物種類、收獲季節、氣候及采后處理等因素的影響[38]。同時由于葉酸性質不穩定性[39],極易被熱、光和氧氣氧化降解,且葉酸包埋在基質中,不利于提取[40],而且許多生物材料含有內源性共軛酶和能夠引起各種形式葉酸相互轉化及分布變化的酶類,影響葉酸檢測結果[41],因而分析植物源食品中葉酸具有挑戰性。

4.1 葉酸的提取

抗氧化劑、α-淀粉酶、蛋白酶及結合酶、料液比、pH等均影響葉酸的提取效果。

4.1.1 抗氧化劑 在提取葉酸時,由于大部分還原型葉酸穩定性差,因此萃取過程中一般都要加用抗氧化劑,通常為抗壞血酸和還原型硫醇單獨使用或聯用。Jastrebova等[42]研究了抗壞血酸鹽水平對葉酸穩定性的影響,在同樣添加0.1% 2-巰基乙醇的基礎上,分別添加0.5%、1%、2%的抗壞血酸鹽,四氫葉酸的損失率分別為42%、18%、8%,說明2%的抗壞血酸鹽能更好地保證四氫葉酸的穩定性。同時,De Brouwer V[43]發現巰基乙醇通過去除熱處理過程中由抗壞血酸釋放的甲醛來穩定四氫葉酸。抗氧化劑對保證葉酸的穩定性很重要,在提取葉酸時應加入適當比例的抗壞血酸、巰基乙醇等。

4.1.2 蛋白酶和淀粉酶 對于富含淀粉和蛋白質的大豆、小麥、乳制品等須用α-淀粉酶、蛋白酶及結合酶三酶聯合處理,將葉酸從富含蛋白質和淀粉的樣品中釋放出來,提高可測定的葉酸含量[44]。對于水果和蔬菜而言,添加淀粉酶、蛋白酶則是不必要的,Shohag[45]發現這兩種酶的添加對葉酸含量測定的結果無顯著性影響。

4.1.3 料液比 Patring等[46]研究了料液比對提取酵母中葉酸的影響,對5-甲基四氫葉酸而言，不同的料液比下其提取量無顯著差異。對四氫葉酸而言,一定的提取液所包含的樣品越少,檢測到的葉酸含量越高,這表明樣品組織影響檢測結果,可能是由于四氫葉酸結合在樣品組織中,較大的料液比限制了它的釋放。Shohag[47]研究了料液比對提取菠菜時葉酸回收率的影響,5 g菠菜加入5～40 mL提取液,發現葉酸回收率先隨著提取液的增加而增加,當提取液為15 mL時達到最大,之后并沒有顯著的增加,表明合適的料液比可獲得最大的葉酸提取量。

4.1.4 pH 不同形式葉酸在不同pH條件下穩定性不同,De Brouwer V[43]研究了pH對不同形式葉酸穩定性的影響,結果表明蝶酰谷氨酸和5-甲基四氫葉酸在pH2～10時無論加熱與否均相對穩定;除去在pH2條件下加熱時降解25%,10-甲酰葉酸在多數pH下均呈現較強的穩定性;四氫葉酸在pH<5時呈現不穩定性。Zhang等[48]研究了提取液pH對菠菜中葉酸的影響,發現受pH影響最大的是四氫葉酸,在低pH下,其回收率較低,但隨著pH的升高使提取液達到中性或堿性時其回收率可增加至原來的2倍;5-甲基四氫葉酸在酸性條件下則更為穩定;5-甲酰四氫葉酸的回收率在pH為5處達到最大值。因此,在測定葉酸時應選擇pH合適的提取液。

4.1.5 去谷氨酸化 無論是用微生物法還是高效色譜法均無法測出多聚谷氨酸葉酸,故必須使用結合酶將其降解為單谷氨酸葉酸或雙谷氨酸葉酸。Patring[46]發現,酵母的質量和大鼠血清的體積比對于是否能實現葉酸的完全軛合起至關重要的作用,但在使用前必須先除去內源性葉酸。在去谷氨酸化過程中,經常使用的軛合酶有大鼠血漿、大鼠血清、豬腎、雞胰、人類血漿等。酶的選擇取決于應用何種分析方法,若使用微生物法,由于雞胰較易獲得,且活性高而廣泛使用。若使用高效液相色譜法,由于該方法分離葉酸單谷氨酸形式,所以選擇最終產物為葉酸單谷氨酸的酶,如豬腎和血漿。

綜上所述,在提取葉酸時,應注意選擇合適的料液比,使葉酸充分溶解在中性及偏堿性提取液中,同時添加抗氧化劑維持葉酸的穩定性。對于富含淀粉及蛋白質的大豆、小麥、乳制品等樣品,應添加蛋白酶及淀粉酶,使葉酸釋放出來。對所有樣品而言,最終都應添加結合酶,將多谷氨酸葉酸降解為單谷氨酸葉酸或雙谷氨酸葉酸,以此提高葉酸檢測量的準確度。

4.2 葉酸的純化

在樣品經過高效液相色譜分析葉酸含量前,固相萃取技術是常用的凈化處理技術,其中強陰離子交換柱(SAX)被廣泛使用[49-50],Nilsson等[51]探討了固相萃取技術對樣品中雜質的去除作用,結果表明SAX、苯基封端柱(PH EC)結合使用時最大程度地降低了干擾組分,而二者單獨使用時對清除5-甲酰四氫葉酸附近的雜質并沒有效果。固相萃取技術效果好,但操作繁瑣,Zhang等[48]使用截留分子量為5 kDa的膜進行超濾,可去除部分雜質,純化效果好。

4.3 葉酸的檢測技術

4.3.1 微生物法 測定葉酸的國家標準(GB 5009.211-2014)方法為微生物法,其主要原理是:葉酸是鼠李糖乳桿菌生長所必需的營養素,在一定控制條件下,將鼠李糖乳桿菌液接種至含有試樣液的培養基中,培養一段時間后測定透光率或吸光度值,根據葉酸含量與透光率(或吸光度值)的標準曲線,計算出樣品中葉酸含量。張旭等[52]比較了酪乳酸桿菌和糞鏈球菌測定葉酸含量的效果,發現兩種微生物檢測結果均有良好的重復性。微生物法有應用范圍廣、樣品前處理簡單等優點,但是有一定的局限性[53],如樣品中其他成分以及環境添加容易干擾結果、操作過程復雜、操作周期長、僅能對葉酸總量進行測定,而不能測定單一葉酸。

4.3.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法因其對不同形式的葉酸進行分離并進行定量分析而在葉酸的檢測中得到廣泛應用[54]。而且,高效液相色譜法具有適用范圍廣、分離效果好、操作簡便、分析速度快等特點。

高效液相色譜法的常用檢測器包括熒光檢測器、電化學檢測器及紫外檢測器等,其中熒光檢測器和電化學檢測器檢測靈敏度高,但由于葉酸結構的多樣性并不適用于所有的葉酸檢測,UV檢測器可以檢測到所有形式的葉酸,但靈敏度低,以致不能檢測到樣品中含量較低的葉酸[48]。Shohag[55]首次使用LC-UV/FLD獲得發芽大豆和綠豆葉酸含量和組成數據,所得出的總葉酸含量與穩定同位素稀釋測定法一致,表明該方法可靠性較高。

4.3.3 高效液相色譜-質譜法 LC-MS及LC-MS/MS聯用技術應用于天然產物成分的分析研究,不需要對樣品進行繁瑣和復雜的前處理,具有高效快速、靈敏度高等特點,尤其適于含量少、不易分離或在分離過程中容易丟失的組分。因此,該方法自誕生以來便得到了突飛猛進的發展。迄今,同位素稀釋法結合LC-MS檢測被認為是檢測葉酸最精確的方法,因為使用同位素標記的類似物作為內標,糾正了樣品在提取與凈化處理過程中葉酸的損失[55]。

使用LC-MS及LC-MS/MS聯用技術時,不同的實驗條件對實驗結果影響較大,Zhang等[48]研究了不同緩沖液對實驗靈敏度的影響,結果表明,在其中添加0.1%的乙酸,獲得了葉酸和甲氨蝶呤最佳的離子化效果。

5 展望

由于葉酸對人體健康的重要性,且植物源食品是人體獲取葉酸的主要方式,提高植物源食品中葉酸含量一直是研究熱點。目前,對于植物中葉酸的生物合成途徑有了一定的認識,同時通過基因工程、發芽調控手段富集葉酸也取得一定進展,但擴大基因工程在提高植物源食品中葉酸含量的應用范圍及開發更有效的發芽調控富集葉酸技術仍有待進一步研究。鑒于葉酸測定方法較為復雜,且測定結果準確性受眾多因素影響。因此,亟待開發快速而準確的葉酸測定方法,同位素稀釋法結合LC-MS檢測葉酸雖已取得良好進展,但仍有待繼續提高,以滿足研究及生產的需要。掌握葉酸的生物合成途徑,進一步開展植物性食品中葉酸的富集與提取技術研究,將有助于改善世界范圍內葉酸缺乏狀況,對消除人體因葉酸缺乏引起的巨幼紅細胞性貧血、胎兒神經發育缺陷等疾病的發生,降低心血管疾病、癌癥等發病率具有重大的意義。

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