樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性分析

秦政 鄭永杰 桂麗靜 謝谷艾 伍艷芳

摘 要：為分析樟樹（Cinnamomum camphora）葉綠體基因組密碼子偏好性使用模式，該研究利用CodonW、EMBOSS、R語言等軟件和程序，對53條樟樹葉綠體基因組密碼子使用模式及偏好性進行了系統分析。結果表明：樟樹葉綠體基因的有效密碼子數（ENC）在36.82～59.30之間，表明密碼子的偏好性較弱。相對同義密碼子使用度（RSCU）分析發現RSCU>1的密碼子有32個，其中28個以A、U結尾，表明第3位密碼子偏好使用A和U堿基。中性繪圖分析發現GC3與GC12的相關性不顯著，回歸曲線斜率為0.049，說明密碼子偏好性主要受到自然選擇的影響。ENC-plot分析發現大部分基因落在曲線的下方，同樣表明選擇是影響密碼子偏好性的主要因素。該研究發現共有9個密碼子（UUU、CUU、UCA、ACA、UAU、AAU、GAU、UGA、GGA）被鑒定為樟樹葉綠體基因組的最優密碼子。

關鍵詞：樟樹，葉綠體基因組，密碼子偏好性

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）10-1346-10

Abstract：In order to analyze the codon usage patterns of the chloroplast genome of camphora tree，53 CDS（coding DNA sequences） were selected from the chloroplast genome of camphora tree and the codon usage pattern and bias were analyzed? by CodonW，EMBOSS，R language and other softwares. The results showed that the effective codon number（ENC） of the chloroplast gene ranged from 36.82 to 59.30，indicating that bias of codons was weak. There were 32 codons with relative codon usage greater than 1，of which 28 were rich in A and U，indicating that the 3rd position of codon prefers A and U genetic bases. Neutral analysis found that the correlation between GC3 and GC12 was not significant，and the slope of the regression curve was 0.049，suggesting that codon bias was mainly affected by natural selection，while the ENC-plot analysis found that most genes fell below and around the curve. It was shown that the mutation also affected the formation of codon bias. Eventually，nine codons（UUU，CUU，UCA，ACA，UAU，AAU，GAU，UGA，GGA） were identified as the optimal codons for the chloroplast genome of camphora tree.

Key words：Cinnamoum camphora，chloroplast genome，codon bias

編碼相同氨基酸的不同密碼子被稱為同義密碼子。在生物體中，同義密碼子的出現具有非隨機性，即某一物種通常傾向于使用一種或幾種特定的密碼子，該現象被稱為密碼子使用偏好性（codon usage bias，CUB）（Grantham et al，1980; Marín et al，1989）。密碼子使用模式的分析從分子生物學層面揭示了基因調控、基因表達、蛋白質二級結構、選擇性轉錄等現象。其中，不同生物體密碼子使用產生偏好性是突變壓力和自然選擇下的結果（Duret & Mouchiroud，1999; Gu et al，2004; Mg & De Farias，2006）。利用不同物種在密碼子使用上的偏好性，可以提高蛋白表達的效率和準確性（Gerrit & Diarmaid，2016; Lee et al，2009）。葉綠體是植物生命活動的代謝中心，在植物光合作用和生物合成中具有重要作用（Neuhaus & Emes，2000）。植物葉綠體基因組規模小、拷貝數多，且在分子水平上多個基因的功能得到驗證，已成為當今生物學領域的研究熱點（Xu et al，2011）。1986年首次公布了煙草（Nicotiana tabacum）（Shinozaki et al，1986）和地錢（Ohyama et al，1986）（Marchantia polymorpha）的葉綠體基因組。目前，在NCBI網站上的細胞器基因組數據庫中已有包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Sato et al，1999）、水稻（Oryza sativa）（Hiratsuka et al，1989）、草莓（Fragaria × ananassa）（Cheng et al，2017）和連翹（Forsythia suspensais）（Wang et al，2017）等在內的約800種植物完整的葉綠體基因組信息。

樟屬植物全世界有250～300種，我國約有46種，主要分布在南方各省區。這些植物不僅可用于提取精油作為化工及醫藥上的重要原料，同時還是重要家具、建筑及雕刻等用材樹種。作為樟屬植物中的代表性植物，樟樹（Cinnamomum camphora）集材用、藥用、香料、油用、生態環境建設和生態文化等于一體，極具開發和利用價值。Chen et al（2017）的研究表明樟樹葉綠體基因組全長152 570 bp，具有特征性的保守四聯體結構，在編碼區和非編碼區都檢測到共40個重復結構和83個簡單重復序列。目前，關于樟樹葉綠體密碼子使用偏好性的研究還未見報道。本研究通過對樟樹葉綠體基因組中53個基因的密碼子使用偏好性進行分析，在揭示影響密碼子偏好性最主要因素的同時還找出了最優密碼子，旨在為樟科植物葉綠體基因組學的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 序列的獲取

在NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載樟樹及其他樟科植物的葉綠體基因組信息。樟樹葉綠體基因組序列的GenBank登錄號為MF156716.1，共注釋83條蛋白質編碼基因序列。為避免計算密碼子偏好性時出現樣本偏差，在剔除重復序列后，最終獲得53條編碼區長度大于300 bp且以ATG為起始密碼子，TAA、TGA或TAG為終止密碼子的基因序列用于后續分析。

1.2 方法

1.2.1 密碼子偏好性分析 用CodonW1.4.2（http：//sourceforge.net/projects/codonw）和Excel 2013統計各基因的密碼子出現次數（codon number，CN）、有效密碼子數（effective number of codon，ENC）（Novembre，2002）和同義密碼子相對使用度（relative synonymous condon usage，RSCU）（Sharp & Li，1986）。用EMBOSS（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）中的CUSP程序分析樟樹葉綠體基因組中各基因的GC總含量和密碼子第1位、第2位、第3位的GC含量，分別用GCall、GC1、GC2和GC3表示。GC3S表示同義密碼子第3位的GC含量。樟樹葉綠體基因組中各基因的部分參數的相關性及顯著性用R語言分析。

1.2.2 中性繪圖分析 中性繪圖法的作用為初步判斷選擇或突變對密碼子使用偏好性的影響。在Origin 9.1軟件中，繪制散點圖并做直線擬合分析。在直線擬合分析中，當回歸系數接近1時，表明GC12與GC3間的相關性顯著，密碼子的堿基組成在3個位置上無差異，密碼子偏好性的主要決定因素為突變;當回歸系數接近0時，GC12與GC3之間相關性不顯著，說明密碼子3個位置上的堿基組成不同，密碼子的使用更多地受到選擇影響。

1.2.3 ENC-plot繪圖分析 ENC-plot繪圖用于分析突變在密碼子使用模式中的作用。當實際ENC值與預期ENC值差異較小時，表明突變對密碼子偏好性影響較大，反之選擇為影響密碼子偏好性的主要因素。此外，還可根據ENC值的高低推斷密碼子偏好性的強弱。ENC值的理論范圍在20～60，值越小表示偏好性越強。當ENC值為20和60兩個極值時，表示同義密碼子具有完全偏好性或沒有偏好性。用R語言繪制二維散點圖，并在圖中構建出ENC值的期望曲線。

1.2.4 PR2-plot分析 為了避免密碼子第3位的AT和GC之間突變不平衡，PR2偏好性分析（PR2-bias plot analysis）僅對4種密碼子編碼的氨基酸做密碼子第3位上A、T、C和G這4種堿基的組成情況分析（Sueoka，1999），并以A3/（A3+T3）|4和G3/（G3+C3）|4的值進行繪圖。其中，“|4”表示四密碼子氨基酸，分別為丙氨酸、精氨酸（CGA，CGT，CGG，CGC）、甘氨酸、亮氨酸（CTA，CTT，CTG，CTC）、脯氨酸、絲氨酸（TCA，TCT，TCG，TCC）、蘇氨酸和纈氨酸。PR2-plot圖的中心點為A=T，C=G，以該點發出的矢量表示堿基偏移的程度和方向。

1.2.5 最優密碼子分析 對前期篩選出的53條基因的ENC值從小到大進行排序，兩端各選出10%的基因建庫，在高低兩個基因庫中將對應密碼子的RSCU值相減得到ΔRSCU，選取ΔRSCU > 0.08的密碼子作為高表達密碼子。將前文分析中RSCU值大于1的高頻率密碼子與ΔRSCU > 0.08高表達密碼子的結果相結合，從而確定出最優密碼子（胡莎莎等，2016; 羅洪等，2015）。

1.2.6 系統進化樹的構建與分析 使用MAFFT 7.397（Katoh & Standley，2013）（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）將樟樹與其他八種樟科植物的葉綠體基因組序列做多序列比對分析。選擇銀杏和云杉作為外類群。用BioEdit手工校正比對結果后導入MEGA7.0中用系統鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建進化樹。用Bootstrap method進行重復檢驗1 000次得出結果。

2 結果與分析

2.1 樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性分析

利用CodonW1.4.2分析樟樹葉綠體基因組中53條候選基因的密碼子組成（表1）。表1結果顯示，平均GC含量為39.1%，且分布趨勢為GC1（46.81%）>GC2（38.77%）>GC3（31.77%），表明在密碼子的3個位置上GC并不是均勻分布，且第3位密碼子偏好使用A和U堿基。葉綠體基因組ENC的取值范圍為36.82～59.3，且大部分在45以上，說明樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性較弱。

圖1結果顯示，RSCU值大于1的密碼子數目為34個。其中，第3位上的堿基為U、A和G的數目分別為16、13和2，說明U和A為葉綠體基因組密碼子的偏好堿基。53條基因的GC含量、ENC和CN間相關性分析結果（表2）顯示，GCall與GC1、GC2和GC3呈極顯著相關，但GC1、GC2和GC3的相關性水平不顯著。ENC與GC3相關系數為0.27，呈顯著相關，說明密碼子的使用偏好性受第3位堿基的影響較大。CN與GC3、ENC顯著相關，表明GC3和密碼子的偏好性受基因序列長度的影響。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析結果（圖2）顯示，GC12 和GC3的分布范圍都較為集中，GC12的范圍在0.343 1～0.545 8，GC3在0.224 4～0.521 4。GC12與GC3的相關系數為0.143，回歸系數為0.049，說明兩者的相關性不顯著，密碼子第3位與第1位、第2位的進化方式可能存在一定差異。因此，樟樹葉綠體基因密碼子偏好性主要受到選擇的影響。

2.3 ENC-plot繪圖

從圖3可以看出，大部分基因落在期望曲線的下方，表示ENC實際值與ENC預期值之間差異較大，說明樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性更多受選擇的影響。

2.4 PR2-plot分析

通過PR2-plot繪圖進一步分析樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性的影響（圖4）。當A、 T、 C和G四種堿基的使用頻率，即A=T，C=G時，密碼子使用偏好性不受選擇和突變影響（Sueoka，2001）。圖4顯示，4個區域中的基因位點分布不均勻，左上方位置的個數較多，說明在第3位堿基的選擇上密碼子具有偏好性，且堿基A的使用頻率高于T，堿基C的使用頻率高于G。因此，可推論選擇是樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性的主要影響因素。

2.5 最優密碼子的確定

對53個候選基因的ENC值進行排序后，先從兩端各選取10%的基因建立高、低表達基因庫;然后計算兩個表達庫中密碼子的RSCU值和兩個庫中的ΔRSCU值（表3）;最后確定了26個密碼子為樟樹葉綠體基因組高表達密碼子。對26個密碼子的第3位堿基進行分析，其中，以U結尾的有5個，以A結尾的有5個，以C、G結尾的分別為6個和10個。結合26個高表達密碼子和圖1的32個高頻密碼子，選取兩者的公共部分，最后確定了9個樟樹葉綠體基因組最優密碼子，分別為UUU、CUU、UCA、ACA、UAU、AAU、GAU、UGA、GGA。其中，所有密碼子均以U或A結尾。

2.6 系統進化樹的構建與分析

比較葉綠體基因組序列可以揭示近緣物種類群之間的系統進化關系，同時闡明植物的進化模式（Kim et al，2015）。為深入了解樟樹在樟科植物的進化規律和關系，將樟樹與其他8種樟科植物的葉綠體基因組序列共同構建系統進化樹，選取裸子植物的銀杏和云杉為外類群（圖5）。圖5結果顯示，樟科植物的葉綠體基因組單獨聚為一枝，與外類群區分明顯。樟樹與沉水樟的葉綠體基因組親緣關系最近，且兩者均為樟科樟屬植物的成員，因此推測兩者可能具有相似的密碼子偏好性模式。用相同方法對沉水樟葉綠體基因組進行中性繪圖（圖6）和ENC-plot繪圖（圖7）發現，GC12與GC3的回歸系數接近0（為0.053），同樣在ENC-plot繪圖中，大部分基因落在期望曲線的下方，兩者都說明選擇是影響沉水樟葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素。這與樟樹的分析結果類似，表明樟科或樟屬植物在進化過程中自然選擇因素對葉綠體基因組密碼子偏好性的影響較大。

3 討論

同義密碼子在不同物種間和同一物種的不同基因間使用都具有一定偏好性，高表達量的基因通常具有最優密碼子且其密碼子偏好性往往更強（Ghaemmaghami et al，2003; Goetz & Fuglsang，2005; Ingvarsson，2007）。Zhou et al（2008b）的研究發現植物葉綠體基因組中密碼子結尾處的堿基更偏好使用A或T。本研究發現在樟樹葉綠體基因組中GC3與GC1、GC2相關不顯著，且GC3的比例為三者中最低，因此得到類似結果，即偏好密碼子多以A或T結尾，這與蘋果（Malus × domestica）（金桂花等，2014）、杉木（Cunninghamia lanceolata）（鄭薇瑋等，2016）和柿（Diospyros kaki）（傅建敏等，2017）等植物密碼子偏好性研究結果一致。

密碼子偏好性的形成原因受多種因素影響，除了最主要的突變和自然選擇外（Rao et al，2011），堿基組成差異（Romero et al，2000）、基因編碼結構（Rao et al，2011）、tRNA豐度（Novoa & Pouplana，2012）等多種因素也會影響其偏好性。其中tRNA的表達豐度最高，相應的密碼子偏好性就越強（Duret，2002; Hershberg & Petrov，2008）。本研究通過對樟樹葉綠體基因組三個不同位置上的密碼子堿基組成及密碼子相關系數進行研究，經中性分析、ENC-plot分析和PR2-plot等分析后發現，選擇是影響樟樹葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素，突變對密碼子的偏好性影響較小。在陸地棉（Gossypium hirsutum）（尚明照等，2011）、糜子（Panicum miliaceum）（劉慧等，2017）、普通油茶（Camellia oleifera）（王鵬良等，2018）等植物的葉綠體基因組密碼子偏好性分析中，也得到了與本研究相似的結果。然而，在對擬南芥和楊樹（Zhou et al，2008a，b） 葉綠體基因組密碼子偏好性的研究中發現，突變是主要的影響因素。由此可見，植物密碼子偏好性受多重因素共同影響且影響不同植物密碼子偏好性的主要因素也不同。

強正向選擇和突變壓力作用下往往會形成大量的最優密碼子，相反純化選擇和突變壓力作用下最優密碼子數目相對較少（Hershberg & Petrov，2008; 宋輝等，2015）。本研究將高頻密碼子和高表達密碼子分析相結合，共篩選出9個樟樹葉綠體基因組中的最優密碼子，且這些密碼子都以A和U堿基結尾，該結果與前人在蒺藜苜蓿（楊國鋒等，2015）、水稻（Zhou et al，2008a）等植物中的研究相吻合。在系統進化樹中，分枝越長的物種表明其進化速率相對更快，進化樹中異色土楠自成一枝且分枝相對較長，這與前人發現它是在進化中首先與其他樟科植物分離的物種的觀點相吻合（Hinsinger & Strijk，2017）。同時，通過分析發現樟樹與沉水樟的密碼子偏好性都主要受到選擇的影響，說明親緣關系越近的物種可能具有越相似的密碼子偏好性。本研究對今后提高目的基因的表達效率具有重要作用，而樟科植物葉綠體基因組密碼子分析也將為今后被子植物的系統發育研究提供重要的參考價值（Moore et al，2007; Ruhfel et al，2014）。